Name: improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00
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लेखक Elisabeth हेलेना Bruun, सारा क्रिस्टीन Christensen, और नील्स एम Kristiansen तकनीकी सहायता के लिए, और Lundbeck फाउंडेशन अनुदान संख्या R155-2013-14113 स्वीकार करना चाहते हैं ।

सुअर दिमाग डेनिश खाद्य उद्योग के शोधकार्य के रूप में प्राप्त किया गया । डेनिश बूचड़खानों सख्त पर्यवेक्षण और पर्यावरण और खाद्य मंत्रालय डेनमार्क द्वारा निरीक्षण के अधीन हैं । 
 astrocytes के अल?...

pBEC का शुद्धिकरण और प्रसार
शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान, महत्वपूर्ण कदम मेनिन्जेस और सफेद और भूरे रंग की बात है, जो शुद्धि उपज और पवित्रता और मॉडल की उचित स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है की जुदाई क...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Low Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma derived serum (PDS)</td>
			<td>First Link UK Ltd.</td>
			<td>60-00-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10-270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-CPT-cAMP</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO 20-1724</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,824,296</td>
			<td>Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made with Elga System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CLS3401</td>
			<td>12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 &#956;m polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>377224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910/159920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morten</td>
			<td>REF0211</td>
			<td>Type 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 &#956;m filters</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>NY4H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndOhm chamber system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-12</td>
			<td>EndOhm chamber for 12mm Culture Cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 electrode system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523+STX100C</td>
			<td>TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long needle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Attach to a syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip curved forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>12-409-12-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad tip forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder</td>
			<td>MERCK Milipore</td>
			<td>Swinnex-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617509F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SSt20ESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Occludin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31721</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 Catenin antibody</td>
			<td>BD Transduction laboratories</td>
			<td>610133</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Claudin 5 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4502981</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC100X250UC</td>
			<td>0.15&#181;l/ml final working conc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td>10 &#181;g/ml final working conc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य शुद्धि और pBECs की खेती के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया प्रस्तुत करता है और इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) मोनो में pBECs पर आधारित मॉडल-संस्कृति (mc), astrocyte के साथ mc-वातानुकूलित माध्यम (ACM), और स्थापित करने के लिए सुअर या चूहा मूल के astrocytes के साथ गैर संपर्क सह संस्कृति (एन सी सी) । pBECs घरेलू सूअरों 5-6 महीने पुराने के मस्तिष्क cortices से केशिकाओं के टुकड़े से अलग और संस्कृति थे । इन टुकड़ों मेनिन्जेस, अलगाव और ग्रे मैटर, निस्पंदन, एंजाइमी पाचन, और केंद्रापसारक के homogenization के सावधान हटाने के द्वारा शुद्ध थे । आगे दूषित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, केशिका टुकड़े puromycin युक्त माध्यम से संस्कृति थे । जब 60-95% धाराप्रवाह, केशिका टुकड़ों से बढ़ pBECs पारगंय झिल्ली फ़िल्टर आवेषण के लिए पारित किया गया और मॉडलों में स्थापित । बाधा जकड़न और pBECs के BBB विशेषता phenotype बढ़ाने के लिए, कोशिकाओं को निंनलिखित विभेद कारकों के साथ इलाज किया गया: झिल्ली permeant 8-CPT-शिविर (यहां संक्षिप्त शिविर), hydrocortisone, और एक phosphodiesterase अवरोध करनेवाला, आरओ-20-1724 (आरओ) । प्रक्रिया 9-11 दिनों की अवधि में किया गया था, और जब एनसीसी मॉडल की स्थापना, astrocytes 2-8 सप्ताह पहले से संस्कृति थे । प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन उच्च प्रतिबंधित paracellular पारगम्यता के साथ endothelial परतों की स्थापना की अनुमति दी गई है, एनसीसी मॉडल के साथ एक औसत transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ) दिखा रहा है १२४९ ± ८० Ω मुख्यमंत्री 2, और paracellular पारगम्यता (Papp) के लूसिफ़ेर पीला के लिए ०.९० 10-6 ± ०.१३ 10-6 सेमी सेक-1 (मतलब ± SEM, n = 55) । इसके अलावा इस pBEC phenotype के मूल्यांकन ने तंग जंक्शन प्रोटीन्स claudin 5, ZO-1, occludin और adherens जंक्शन प्रोटीन p120 catenin की अच्छी अभिव्यक्ति दिखाई । प्रस्तुत मॉडल स्वास्थ्य और रोग में BBB के अध्ययन की एक सीमा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और, अत्यधिक प्रतिबंधात्मक paracellular पारगम्यता के साथ, इस मॉडल परिवहन और intracellular तस्करी के अध्ययन के लिए उपयुक्त है ।

BBB इन विट्रो मॉडल की स्थापना
प्रस्तुत, अनुकूलित विधि में, pBECs की खेती और एम सी के साथ या ACM या astrocytes के साथ एन सी सी के बिना पारगंय झिल्ली डालने प्रणाली की स्थापना (?...

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Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

एक इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बैरियर मॉडल सुअर मस्तिष्क Endothelial कोशिकाओं पर आधारित की स्थापना के लिए बेहतर विधि

प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) प्राथमिक सुअर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (pBECs) के आधार पर मॉडल की स्थापना के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया मौजूद है । मॉडल उच्च reproducibility, उच्च तंगी से पता चलता है, और दवा की खोज में परिवहन और intracellular तस्करी के अध्ययन के लिए उपयुक्त है ।

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

रक्त मस्तिष्क बाधा के विघटन एमआरआई निर्देशित एक चूहे मॉडल में Transcranial केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

रक्त मस्तिष्क बाधा विघटन के चूहे मॉडल Neurovascular चिकित्सा लक्षित करने के लिए अनुमति दें

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

एक के रूप में मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (cEND) में खिंचाव<em&gt; इन विट्रो में</emब्लड ब्रेन बैरियर के&gt; घाव मस्तिष्क चोट मॉडल

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

सेटिंग अप एक<em&gt; इन विट्रो</emचूहा रक्त मस्तिष्क बाधा के&gt; मॉडल (BBB): बीबीबी अछिद्रता और रिसेप्टर की मध्यस्थता परिवहन पर ध्यान केंद्रित

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

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एक के रूप में मस्तिष्क Microslices की excitotoxic उत्तेजना<em&gt; इन विट्रो</em&gt; स्ट्रोक के मॉडल

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

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एक के रूप में ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और Reoxygenation<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Ischemia-reperfusion चोट मॉडल का अध्ययन रक्त मस्तिष्क बाधा शिथिलता के लिए

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

चूहे में श्वासनली के रैपिड इंटुबैषेण के लिए एक बेहतर तरीका

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

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ट्रांसपेडिकुलर शिकंजे के मूल्यांकन के लिए एक संज्ञाहरण, सर्जरी और हार्वेस्ट पद्धति का उपयोग करना<em&gt; विवो में</em&gt; पोर्सिन लम्बर स्पाइन मॉडल

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

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रक्त मस्तिष्क की बाधा मेष की तरह पोत संरचना और व्यवधान का आकलन करने के लिए विट्रो एसेस में

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

एक Porcin Corneal Endothelial अंग संस्कृति मॉडल विभाजन Corneal बटन का उपयोग

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...