Name: personalized peptide arrays for detection of hla alloantibodies in organ transplantation
Uploaded: 2017-09-06T15:00:00
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Ringraziamo la d. ssa Shawn Li e Li Xing della Western University in Canada per la loro assistenza gentile con SPOT produzione di matrice. Siamo grati ai membri del personale presso il nucleo di istocompatibilità e presso la completa Transplant Center della Northwestern University per la fornitura di servizi di esempio. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da ausiliari Board di Northwestern Memorial Hospital e da un fondo di avvio facoltà forniti dalla Northwestern University di J.J..

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla Northwestern University Institutional Review Board (IRB protocollo #: STU00104680). Un flusso di lavoro complessivo del protocollo è illustrato nella Figura 1.
 1. analisi bioinformatica di donatore e destinatario HLA sequenze <ol><li>recuperare sequenze dal database di IMGT/HLA 15.
	<ol><li>Il report tipizzazione HLA di ottenere sia il donatore dell'organo e il suo destinatario. <br/...

<ol>
	<li>Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unambiguous+high+resolution+genotyping+of+human+leukocyte+antigens.">Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens.</a> J Immunol Methods. , (2017).</li><li>Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPD--the+Immuno+Polymorphism+Database.">IPD--the Immuno Polymorphism Database.</a> Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).</li><li>Tait, B. 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A., Nickerson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-transplant+assessment+of+donor-reactive,+HLA-specific+antibodies+in+renal+transplantation:+contraindication+vs.+risk.">Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk.</a> Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).</li><li>Haas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+Banff+schema+for+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+renal+allografts.">An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts.</a> Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).</li><li>Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+high-resolution+typing+for+sensitized+patients:+a+solution+in+search+of+a+problem?.">HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem?.</a> Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).</li><li>Tambur, A. R., Claas, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+epitopes+as+viewed+by+antibodies:+what+is+it+all+about?.">HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about?.</a> Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).</li><li>Robinson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IPD+and+IMGT/HLA+database:+allele+variant+databases.">The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases.</a> Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).</li><li>Gabriel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+typing+by+next-generation+sequencing+-+getting+closer+to+reality.">HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality.</a> Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+for+Anti-HLA+Antibody+Detection+Using+Personalized+Peptide+Arrays.">A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays.</a> Transplant Direct. 2 (11), (2016).</li><li>Frank, R., Overwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis.+Epitope+analysis+with+arrays+of+synthetic+peptides+prepared+on+cellulose+membranes.">SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes.</a> Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li><li>Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+protein-protein+interaction+sites+using+peptide+arrays.">Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays.</a> J Vis Exp. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).</li><li>McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Peptide+Microarrays+for+Mapping+Continuous+Antibody+Epitopes.">Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes.</a> Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).</li><li>Li, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+constituent+human+serum+antibodies+elicited+by+vaccination.">Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).</li><li>Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+processing+by+the+proteasome.">Antigen processing by the proteasome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).</li><li>Filippone, E. J., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Humoral+Theory+of+Transplantation:+Epitope+Analysis+and+the+Pathogenicity+of+HLA+Antibodies.">The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies.</a> J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).</li><li>Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acceptable+mismatch+program+as+a+fast+tool+for+highly+sensitized+patients+awaiting+a+cadaveric+kidney+transplantation:+short+waiting+time+and+excellent+graft+outcome.">The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome.</a> Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).</li></ol>

Il design della matrice SPOT descritto qui è per lo studio sperimentale della specificità alloanticorpo nel trapianto contro gli antigeni HLA del donatore di organi. In contrasto con il dosaggio SAB esistente ampiamente utilizzato in clinica, il metodo di matrice di antigene ha un grande vantaggio nel suo design flessibile che può ospitare le vere sequenze HLA del donatore individuale. La nuova piattaforma sfrutta le potenzialità della tecnologia di sequenziamento del DNA rapido avanzamento che sarà presto in grado ...

Terapia del rimontaggio dell'organo che ordinariamente viene condotta in tutto il mondo ha salvato milioni di vite. Trapianto di organo solido si verifica in circa 100 pazienti per milione di persone negli Stati Uniti ogni anno, mentre un numero maggiore sono ancora su liste d'attesa per ricevere i donatori di organi a causa di una grave carenza di approvvigionamento (secondo le informazioni fornite dall'organo Appalti e rete di trapianto - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Trapianto d'organo è altamente regolamentato al fine di ridurre gli sprechi di organo e salvare vite umane, ma gli strumenti scientifici utilizzati per informare questi regolamenti sono limitati in efficacia. Per esempio, la comunità scientifica riconosce pienamente gli Stati altamente polimorfici di molecole HLA e accurati test genetici del DNA mediante battitura a macchina ad alta risoluzione e basato su sequenze digitando (SBT) sono state sviluppate in anni recenti1, 2. Tuttavia, i metodi di collaudo alloanticorpo non sono ancora stati in grado di produrre la vasta gamma di singole sequenze HLA come sonde di antigene. Il test standard al giorno d'oggi utilizza un pannello invariabile di ~ 100 antigeni allelico che sono costituiti da comuni varianti di HLA, A, B, C, DQ, DP e DR sequenze in popolazioni umane3,4,5,6. Frequentemente, sequenze di HLA del donatore effettivo non sono inclusi nel pannello test, costringendo trapianto di medici e chirurghi di dedurre la reattività di donatore-specific sulla base di somiglianze condivise tra donatore effettive sequenze e corrispondenti "standard" nella test kit7,8. Di conseguenza, a volte è difficile fare una stima affidabile del rischio di rifiuto basato su anticorpo prova Risultati9,10,11,12. Di conseguenza, nuove personalmente test personalizzabili per gli alloanticorpi sono urgentemente necessari13,14.
I geni HLA codificano per i recettori (MHC) del complessi maggiore di istocompatibilità hanno una funzione chiave nella risposta immunitaria6. Geni HLA sono conosciuti per essere i più polimorfici geni del genoma umano6. A causa della rapidi progressi nel DNA sequencing strategie per i geni HLA, nuove varianti alleliche (o semplicemente indicati come alleli) vengono scoperti in un esplosivo tasso15,16. Entro il marzo 2017, 16.755 convalidati alleli erano stati depositati al Database IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), di cui 12.351 erano di classe I e 4.404 erano dei gruppi II classe. In netto contrasto, solo poco più di 100 alleli distinti sono rappresentati nel test standard single-antigene Perline (SAB), che è usato ordinariamente per rilevare gli alloanticorpi nel trapianto dell'organo. Il metodo di RFA è costruito su una piattaforma Luminex mediante citometria a flusso. Poiché il test utilizza un set di invariabile di antigeni, a parte minore variabilità di lotti in produzione, la prova di antisiero può essere standardizzata robustamente tra individui e tra laboratori5. Tuttavia, questo test è in grado di catturare tutti gli alloanticorpi sviluppati specificamente contro gli alleli dei donatori, in particolare quando le sequenze del donatore sono assenti dal SAB set. Anche se la produzione personalizzata di antigeni dei donatori basato su sequenze veri sono desiderabili, restano sfide tecniche in procedure di collaudo e di razionalizzare la produzione necessaria.
Recentemente abbiamo descritto una metodologia alternativa in uno studio di fattibilità del trapianto renale soggetti17. Il metodo utilizzato gli antigeni peptidici in un formato di matrice per il sondaggio pre- e post-trapianto sieri di soggetti individuali. Ogni matrice è stato personalizzato costruito utilizzando il punto sintesi metodo18,19,20,21,22,23 che produce antigeni peptidici, ogni 15 amminoacidi di lunghezza, interamente basato su alleli HLA del donatore dell'organo rispettivo di A, B, C, DQA1, DQB1 e DRB1. Sintesi SPOT sono operato su una membrana di cellulosa con standard Fmoc-chimica22 e possono produrre centinaia di peptidi personalizzati in parallelo con un sistema completamente automatizzato robot19,21. La matrice di membrana possa sopportare vari cicli di spogliatura e reprobing cicli. Nel nostro studio retrospettivo17, abbiamo rilevato i cambiamenti nei modelli di antigene con antisieri stored trapianto raccolti in una serie di tempo (cioè, prima e dopo il trapianto). Qui descriviamo il protocollo tecnico per il flusso di lavoro tra cui progettazione, produzione, analisi di sondare e risultato di antisiero. Il metodo è destinato per il rilevamento di alloanticorpi contro epitopi specifici lineari su molecole HLA dei donatori del trapianto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="577">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Peptide array</td>
			<td style="width:141px;">INTAVIS Bioanalytical Instruments</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ethanol</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">E7023</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">P7170</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Non-fat milk</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1706404</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">TBST</td>
			<td style="width:141px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:115px;">10711454001</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Goat anti-human IgG&#8211;HRP&#160;</td>
			<td style="width:141px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">A18811</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1705061</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientifics</td>
			<td style="width:115px;">21059</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">ChemiDoc gel imaging system</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad Laboratories</td>
			<td style="width:115px;">1708265&#160;</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

personalized peptide arrays for detection of hla alloantibodies in organ transplantation

Nei trapianti d'organo, la funzione e la longevità dell'innesto criticamente si basano sul successo del controllo della reattività di rigetto immunologico contro gli antigeni umani del leucocita (HLA). Istocompatibilità linee guida sono basate su prove di laboratorio di immunità anti-HLA, che presenta sia come pre-esistente o de novo generato anticorpi HLA che costituiscono una barriera importante trapianto. Prove correnti sono costruiti su una piattaforma di singolo-antigene Perline (SAB) utilizzando un insieme fisso di ~ 100 antigeni ricombinanti preselezionati per sondare sieri di trapianto. Tuttavia, negli esseri umani esiste una maggiore varietà di tipi di HLA, con nessun due individui diversi da gemelli identici che possono condividere la stessa combinazione di sequenze di HLA. Mentre avanzate tecnologie per la tipizzazione HLA e sequenziamento diretto precisamente è in grado di catturare qualsiasi mancata corrispondenza nella sequenza di DNA tra un donatore e HLA del destinatario, il dosaggio di SAB, a causa della sua limitata varietà nella rappresentazione di sequenza, è in grado di rilevare con precisione gli alloanticorpi specificamente contro il donatore HLA mismatches. Abbiamo cercato di sviluppare un metodo complementare, utilizzando una tecnologia diversa per rilevare e caratterizzare gli anticorpi HLA anti-donatori su base personalizzata. Lo strumento di screening è una matrice su ordinazione del peptide donatore HLA-derivato di sequenze di per sondaggio post-trapianto sieri del destinatario dell'organo per valutare il rischio di rigetto anticorpo-mediato. Su un singolo array per una coppia donatore-ricevente, fino a 600 unici peptidi sono realizzati sulla base sequenze di proteine HLA del donatore, ogni peptide portando almeno un residuo non corrispondente in una sequenza 15-amino acida. Nei nostri esperimenti pilota per confrontare modelli di antigene per sieri pre- e post-trapianto su queste matrici, siamo stati in grado di rilevare i segnali anti-HLA con la risoluzione che ci ha permesso di individuare gli epitopi immuni coinvolti. Questi personalizzato antigene array permettono il rilevamento ad alta risoluzione degli epitopi HLA del donatore-specific nel trapianto dell'organo.

Nello studio originale utilizzando la matrice di proiezione metodo17, abbiamo iscritto un totale di 5 soggetti di trapianto di rene. Abbiamo ottenuto i risultati del nostro gruppo e dei loro rispettivi donatori di tipizzazione di HLA. Loro storia medica e allelica anticorpali da SAB prove erano anche disponibili a noi. Nel nostro studio pilota di questi 5 pazienti, abbiamo messo a punto due diverse metodologie: una matrice standard composta da un pannello fisso di ...

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Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Mancate corrispondenze nelle sequenze (HLA) l'antigene umano del leucocita tra donatore di organi e destinatario coppie sono la principale causa di rigetto anticorpo-mediato nel trapianto dell'organo. Qui presentiamo l'uso di matrici di antigene personalizzati che si basano su sequenze di singoli donatori HLA per sondare gli alloanticorpi di anti-donatori HLA nei destinatari dell'organo.

Personalizzato Peptide matrici per il rilevamento di anticorpi HLA nei trapianti d'organo

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

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Biochimica

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Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elettrochimico rilevamento di deuterio isotopo effetto cinetico su extracellulare di trasporto dell'elettrone nella Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Un'analisi di clivaggio Peptide fluorogenico alla schermata per attività proteolitica: applicazioni per coronavirus spike l'attivazione della proteina

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...