Name: imaging amyloid tissues stained with luminescent conjugated oligothiophenes by hyperspectral confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2017-10-20T15:00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Mikael Lindgren e Chanan Sluzny per consigli su microscopia di fluorescenza e Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark e Kurt Zatloukal per contribuire in sezioni di tessuto o micrografie visualizzati in questa pubblicazione. La raccolta dei dati presentati nel presente documento è stata finanziata dai contributi degli svedesi Brain Foundation (Hjärnfonden), l'associazione Alzheimer svedese (Alzheimerfonden), il Consiglio di ricerca svedese (VR), l'associazione Göran Gustafsson, Georg &#38; Astrid Olsson, progetto EU FP7 Health LUPAS e Università di Linköping.

Nota: sintesi LCO sono stata eseguita nei nostri laboratori per più di un decennio. Essenzialmente applicando protocolli per sostituzione elettrofila aromatica, Palladio catalizzato Croce-accoppiamento, accoppiamento di ammide e idrolisi dell'estere, personalizziamo sinteticamente sonde per scopi diversi 5 , 12. dopo la sintesi, caratterizzazione e purificazione, il prodotto LCO è liofilizzato e conservato a temperatura ambiente. Alcune delle sonde (tra cui hFTAA) sono ora disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali).
 1. soluzione di macchiatura LCO Nota: se hFTAA è stato acquistato da un fornitore commerciale, si prega di seguire il fornitore &#39; s istruzioni invece sezione 1.
HFTAA <ol><li>risospendere il liofilizzato in NaOH per preparare una soluzione madre di 1 mg/mL da 2 mM. Tenere il brodo in un flaconcino di vetro a 4 ° C. Il brodo può essere conservato per un anno.</li>
	<li>Il giorno di macchiatura, preparare una soluzione di lavoro diluendo il magazzino 1: 10.000 in tampone fosfato salino (PBS).</li>
</ol> 2. Preparazione dei campioni di tessuto Nota: molti tipi di tessuto possono essere imaged usando hFTAA come un indicatore dell'amiloide. Vedere la Figura 1 per esempi. hFTAA è sensibile alla conformazione aggregata. La macchiatura quindi deve preferibilmente essere eseguita su undisrupted aggregati senza esposizione di epitopo. Qualità spettrale ottimale si ottiene se la fissazione del tessuto è ridotto al minimo. Quindi il materiale congelato fresco, delicatamente fissati in etanolo al momento della colorazione, è comodo. Tuttavia, è possibile rilevare anche i giacimenti di amiloide nel tessuto che è stato risolto con ad es., formalina. hFTAA generalmente penetra il tessuto bene. Selezionare uno spessore di campione che è compatibile con la modalità tecnica di imaging.
<ol><li>Se formalina fisso, parafinembedded sezioni vengono utilizzate, deparafinize in xilene tutta la notte. Immergere le sezioni consecutivi bagni di etanolo al 99%, 70% di etanolo, dH 2 O e PBS, 10 min in ciascuno. Consentire le sezioni di tessuto ad asciugare sotto condizioni ambientali. 
	Attenzione: Xilene è sempre gestito in una cappa chimica. Xilene e altri solventi organici sono dannosi.
	<ol><li>Cryosections scongelare a temperatura ambiente. Difficoltà le sezioni di tessuto in formalina al 10% durante la notte e reidratare tuffandoli in bagni consecutivi di etanolo al 99%, 70% di etanolo, dH 2 O e PBS, 10 min in ciascuno. Consentire le sezioni di tessuto ad asciugare sotto condizioni ambientali.</li>
	</ol></li> <li>: Aggiungere gocce di soluzione di lavoro di hFTAA (circa 200 µ l) per le sezioni di tessuto per coprirlo. La goccia deve rimanere sul posto dalla tensione superficiale. Incubare per 30 min a temperatura ambiente per la macchiatura.</li>
	<li>Risciacquare fuori la soluzione colorante con 500 µ l PBS utilizzando una pipetta e poi immergere il vetrino in bagno di PBS per 10 min. Consenti la sezione ad asciugare sotto condizioni ambientali.</li>
	<li>Montare utilizzando il mezzo di montaggio di fluorescenza. Consentire il mezzo di montaggio a riposare una notte. 
	Nota: hFTAA colorazione può essere eseguita in combinazione con altri metodi di colorazione quali immunofluorescenza, cell - o organello marcatori specifici, ecc. Per eseguire co-macchiatura, eseguire il protocollo di colorazione completo di scelta e aggiungere hFTAA colorazione alla fine, a partire dal punto 2.2. Per esempi, vedere Figura 2. Per l'immunofluorescenza, scegliere preferibilmente un anticorpo secondario che è eccitato a 640 nm o superiore. In questa gamma di lunghezza d'onda, hFTAA non assorbe e quindi non può essere eccitato e non darà fluorescenza. Questo assicura che nessun trapasso è visto tra hFTAA e anticorpo.</li>
</ol> 3. La microscopia Nota: utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato di filtri di passaggio lungo. Tutte le impostazioni riportate di seguito sono state usate per generare le immagini nella Figura 4. Modifiche potrebbero essere necessario essere fatta a seconda del campione di tessuto e di tipo amiloide. Anche se hFTAA associato a amiloide è stabile verso lo sbiancamento, si consiglia di spegnere la sorgente di luce quando l'esemplare non è esaminato o imaged.
<ol><li>HIS Nota: l'esperimento è stato effettuato usando un microscopio a epifluorescenza con filtri di emissione di passaggio lungo e una testa di macchina fotografica per suo (Vedi Tabella materiali).
	<ol><li>Uso un microscopio a fluorescenza standard è dotato di una fotocamera iperspettrale e filtri di passaggio lungo. Accertarsi che la fotocamera spettrale è calibrata.</li>
		<li>Nel software, il nome del progetto, selezionare &#34; immagine spettrale &#34; e Avvia acquisizione.</li>
		<li>Selezionare l'oggetto di interesse attraverso l'oculare utilizzando il filtro di eccitazione 436-nm e spostare il percorso della luce alla telecamera.</li>
		<li>In the caso Data Manager (CDM), selezionare il tipo di campione Spectral, etichetta il campione, e premere Acquisisci. Verrà aperta la finestra di acquisizione.</li>
		<li>Nella finestra di acquisizione &#34; imaging spettrale &#34;, aprire il menu impostazioni, selezionare acquisizione proprietà e impostare l'intervallo spettrale di 460-700, la qualità di velocità alla massima velocità e la misurazione digitare al filtri gas/laser/sottile. Chiudere la finestra di dialogo.</li>
		<li>Nel menu immagine, selezionare live completo. Nella barra di icone, disattivare frange. Selezionare o ridimensionare un'area di immagine che ha il valore di memoria di picco inferiore a 800 MB. Impostare il tempo di esposizione su un valore che dà una luminosità di immagine totale tra 1.000 e 3.000. Nella barra di icone, premere la fotocamera colorata. Acquisizione avrà inizio. Quando l'acquisizione di immagini è completo, premere Salva nella &#34; Acquisisci immagine spettrale &#34; nella finestra di dialogo e &#34; nuova cella &#34; nella finestra di dialogo Gestione dati caso.</li>
		<li>Da the CDM, aprire l'immagine raccolto utilizzando il pulsante di analisi di inizio. Verrà aperta la finestra di analisi di dati.</li>
		<li>Spectral informazioni possono essere raccolti da ogni pixel dell'immagine selezionando ROIs utilizzando la finestra di dialogo visualizzazione spettrale. Scegliere &#34; definire &#34; e selezionare ROIs dalle pertinenti aree dell'immagine.</li>
		<li>Salvare i dati spettrali come un file di testo utilizzando il pulsante di Lib. Il file salvato con estensione txt possa essere importato a qualsiasi software di analisi di scelta. Il file. SLB può essere utilizzato per l'analisi all'interno del software di analisi dati. I dati del cubo iperspettrali da tutta l'immagine possono anche essere esportati come un file raw, come &#34; strati come tif &#34;, o come &#34; strati in formato testo &#34; per applicazioni di analisi di dati e immagini utilizzando software esterni.</li>
	</ol></li> <li>Microscopia confocale Nota: il microscopio confocale è dotato di un laser sintonizzabile come la sorgente di eccitazione. Per tutti gli esperimenti di emissione di fluorescenza, impostare l'intensità del laser allo 0,2% (corrispondente a una potenza media di 3 µW), il foro stenopeico per 1 unità arioso, le dimensioni della cornice a 1.024 px x 1,024 px, la velocità di scansione come 7 e una media di oltre 16 scansioni e la profondità di bit come 8 bit (vedere < s Trong &gt; tabella materiali). Queste impostazioni devono essere regolati per ogni singolo sistema confocale, sorgente laser e tipo di campione.
	<ol><li>Per lo spettro di emissione, raccogliere i dati utilizzando la modalità di lambda e l'eccitazione mediante argon laser insieme a 488 nm. Raccogliere delle emissioni tra 503 e 687 nm utilizzando 22 canali nel rivelatore GASP a 32 canali. Impostare il guadagno a 755.</li>
		<li>Per ottenere immagini a singolo canale, utilizzare la smart impostata opzione. Per FITC (filtro verde), impostare il guadagno a 750 e per Alexa 535 (filtro rosso) impostare il guadagno a 845.</li>
		<li>Per raccogliere lo spettro di eccitazione con il laser sintonizzabile, uso di eccitazione con 1 nm passi tra 490 e 545 nm, mentre la raccolta delle emissioni tra il 551 e 586 nm. Impostare l'intensità del laser al 2% (corrispondente a una potenza media di 30 µW) e il guadagno a 774.</li>
		<li>Per raccogliere Z-stack in modalità spectral, scansione attraverso la profondità della sezione in passi di 0.96 µm. Le stesse impostazioni di eccitazione e di emissione come descritto al punto 3.2.1 possono essere utilizzate ma impostare il guadagno a 730.</li>
	</ol></li> <li>FLIM Nota: il microscopio confocale è dotato di un'unità FLIM (Vedi Tabella materiali).
	<ol><li>Impostare i seguenti parametri per il microscopio confocale: foro stenopeico, 20; lunghezza d'onda di eccitazione, 490 nm; intensità del laser, 0,5% (corrispondente a una potenza media di 7,5 µW). Utilizzare il laser pulsato a 40 MHz.</li>
		<li>Software in the FLIM, impostare fotone contando oltre 550 nm. Nella finestra parametri, seguire il fotone contando fino a quando il Conte Max è circa 4.000 fotone conteggi.</li>
		<li>Salvare il file ed esportarlo come immagine SPC.</li>
		<li>Adattare i dati a un decadimento esponenziale di 2 componenti del software di FLIM. Una misura che dà un χ 2 &#60; 2 è buona. Il valore sull'asse y è il numero di conteggi per la durata specificata.</li>
		<li>Selezionare una soglia per conteggi includere, ad esempio, 100. Codice di T1 colore e selezionare intervallo di durata. Il decadimento è dipendono dalla struttura dell'amiloide dove è associato il hFTAA. I corsi della vita di fluorescenza tra 300 e 1.000 ps sono stati osservati. Salvare il file.</li>
		<li>Esportare i dati non elaborati utilizzando le opzioni di esportazione e salvare i dati desiderati in una nuova cartella.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+fibril+proteins+and+amyloidosis:+chemical+identification+and+clinical+classification+International+Society+of+Amyloidosis+2016+Nomenclature+Guidelines.">Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines.</a> Amyloid. 23, 209-213 (2016).</li><li>Buxbaum, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+amyloidoses:+are+transgenic+mice+worth+the+time+and+trouble?.">Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble?.</a> FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).</li><li>Hall, A. M., Roberson, E. 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PH PN MB SN sono azionisti minori in Ebba Biotech che commercializza hFTAA sotto il marchio Amytracker545.

Deposizione di proteine aberrante piegati in amiloide è un evento chiave di molti processi di malattia. Placche di amiloide extracellulare costituito da peptidi Aβ e grovigli neurofibrillari intracellulari formati da tau iperfosforilata sono trovati nel cervello di pazienti con malattia di Alzheimer. Una gamma di differenti proteine, ad esempio, transtiretina (TTR), componente del siero amiloide A (SAA) e misfold catena chiara IgG e manifesto come depositi di amiloide nei tessuti di fuori del sistema nervoso centrale. Anche se mancano di amiloide depositi sono stati conosciuti e studiati per oltre un secolo, abbiamo ancora una conoscenza dettagliata di come amiloide deposizione è avviata a livello molecolare e che cosa può essere fatto per impedire questo processo. Per il morbo di Alzheimer, è necessario confermare come il processo di amyloidosis è associato con il neurodegeneration. Una missione chiave sulla missione per curare amiloidosi è sviluppare romanzo messo a punto strumenti per il monitoraggio dell'amiloide inizio, progressione e regressione; quindi mirata rilevazione dell'amiloide è chiave. Diagnostica clinica potranno a lungo termine, aumentando la sensibilità e la selettività dell'amiloide colorazione metodi7,15. Attuali sfide a questo proposito sono tremendi ed sono un'area di ricerca molto attivo. Un problema principale per lo sviluppo clinico e le prove è diagnosi prognostica. Queste malattie probabile iniziare ben prima che i sintomi compaiono, ma per iniziare con trattamento ci deve essere l'identificazione della malattia. Nel presente documento, la sensibilità è un aspetto fondamentale per nuove metodologie. Inoltre, questo problema è ancora più complesso perché alcuni aggregati proteici sono tossici, alcuni sono protettivi, e alcuni sono neutri. Quindi la possibilità di monitorare specifici aggregati morfotipi è essenziale dal momento che l'esistenza di specie distinte di aggregati è stato suggerito per spiegare il fenotipo eterogeneo segnalato per una varietà di malattie neurodegenerative proteina aggregazione. Per esempio, la proteina prionica è un classico esempio di come una sequenza identica primaria degli aminoacidi possa aggregarsi in distinti morfotipi di aggregazione, che danno luogo a ceppi specifici da prioni. Polimorfismo simile inoltre è stato segnalato per il peptide Aβ, α-synuclein e tau. A questo proposito, LCOs hanno dimostrato di essere strumenti eccezionali per assegnazione ottico di morfotipi aggregati distinti. Proteina prionica-ceppo-specifici aggregati, depositi di proteine trovati in parecchi tipi di amiloidosi sistemica, come pure Aβ polimorfico e aggregati di tau sono stati distinti a causa del fenomeno ottico conformazionalmente indotto osservato dal LCOs.
Deposito dell'amiloide è un evento che si svolge nei tessuti che sono difficili da penetrare con metodi biochimici o biofisici di precisione molecolare. La possibilità di sondare eventi ex vivo, in vivoe in vitro usando le stesse molecole LCO pone le basi per unraveling con eventi che si verificano in vivo usando le tecniche che sono solo possibile applicare su ex vivo o in vitro campioni11,17. Un modello strutturale recentemente segnalati ad alta risoluzione mostra che il pentamerica LCO Alca (pFTAA) lega in una cavità formata da catene laterali paralleli con l'asse della fibrilla che attraversa 6 a registro parallelo beta-fili18, dimostrando che è possibilità di acquisire conoscenze di risoluzione atomica relative alle entità del target LCO. In sostanza la modalità di associazione di cavità e l'associazione di pFTAA è simile a colore rosso di Congo19, dettata da una scanalatura fiancheggiata da ripetitivi positivo carica Lys-catene laterali. L'affinità di LCOs sembrano essere migliore rispetto al rosso Congo probabilmente grazie alla catena di flessibilità e forti interazioni di van der Waals degli atomi dello zolfo degli anelli tiofene verso la cavità idrofobica. La rilevazione di specie prefibrillar (prima risponde ThT)5,20 appare dipenda su fogli β ripetitivo, composti nel registro parallelo-beta-fili, che per hFTAA essere due unità di tiofene più di pFTAA sarebbe intervallo di attraversamento di fino a 8 beta-fili.
Il protocollo di colorazione richiede prestando attenzione alla risoluzione dei problemi presso i seguenti passaggi: (i) fissazione: vasta fissazione dei campioni di tessuto possa alterare la struttura dell'amiloide e limitare la possibilità di rilevare la variazione negli spettri di fluorescenza indotti da distorsione conformazionale della molecola hFTAA. La fissazione mite di cryosections da materiale fresco congelato è preferita per ottenere una ottimale risoluzione spettrale. Tuttavia, hFTAA si macchia e reagiscono in amiloide nel tessuto fisso ma con efficacia ridotta e meno variazione spettrale. (ii) epitopo esposizione: pretrattamento del tessuto per ottenere l'esposizione epitopo per il grippaggio dell'anticorpo occasionalmente potrebbe ridurre la capacità per hFTAA da associare a causa delle perturbato struttura dell'amiloide. Se si tratta di un problema, e l'esposizione di epitopo è un passo cruciale nell'anticorpo che macchia protocollo, utilizzando sezioni consecutive per l'anticorpo e hFTAA, rispettivamente può essere considerato. (iii) overstaining: hFTAA è estremamente sensibile. Soluzioni di lavoro dovrebbero essere tenuti a concentrazione bassa nM. Diminuire la concentrazione di hFTAA se la colorazione di fondo è un problema. Se gli elementi che legano hFTAA sono sparsi nel tessuto, un eccesso di hFTAA può aggregare e si accumulano nel mezzo di montaggio. Questo è riconosciuto come la fluorescenza che non è sul piano di messa a fuoco del tessuto stesso. Se questo appare, immergere il vetrino montato in PBS finché il coprioggetto può essere fatto scorrere della sezione, lavate con PBS e rimontare con mezzo di montaggio fresco e un nuovo slittamento del coperchio. (iv) filtro basato su formazione immagine: questo articolo descrive l'imaging di fluorescenza principalmente spettralmente risolte utilizzando filtri di passaggio lungo o più canali di rilevazione. hFTAA può anche essere controllata utilizzando filtri di passaggio corto. Si prega di essere consapevole che questo ridurrà il contrasto e abolire le possibilità per rilevare i colori multipli.
Negli ultimi anni è diventato evidente che come la ricerca di strumenti, LCOs fluorescente e in particolare hFTAA mostrano proprietà altamente promettente. Risultati sono stati dimostrati per una vasta varietà di proteine e Stati di malattia, che vanno dal rilevamento di hFTAA degli aggregati all'interno delle cellule (tau, miosite), amiloide sistematico di amiloide A del siero, transtiretina, catene chiare dell'immunoglobulina (kappa e lambda) seminogelin 1, prion protein (compresi i campioni clinici)21, polipeptide amiloide dell'isolotto e insulina7,15. Un fattore limitante per l'implementazione di hFTAA come strumento diagnostico è che quello microscopia di fluorescenza non è ampiamente utilizzato nei laboratori di patologia sistematica dell'amiloide. Inoltre, la sua non è prontamente disponibile in clinica. Tuttavia, hFTAA la macchiatura dell'amiloide e microscopia di fluorescenza sono stati utilizzati in laboratori clinici in un microscopio a fluorescenza base filtro e dovrebbeessere considerato come un metodo diagnostico gratuito. Questo è stato recentemente dimostrato sulle biopsie del tunnel carpale con amyloidosis di transthyretin utilizzando le impostazioni di base per fluorescenza in un modo automatizzato22.
Inoltre, oltre a varie proteine, hFTAA fluorescenza riconosce una grande varietà di tipi di fibrille e pre-fibrillari aggregati amiloidi, ad esempio, specie fibrillari via sono stati rilevati e caratterizzati. In questa pubblicazione, abbiamo dimostrato una LCO su vari tipi di campione utilizzando tre tecniche di microscopia. L'utilizzo di sintesi controllata ha permesso anche per lo sviluppo di LCOs per versatile rilevamento di target biomolecolari, ad esempio, registrazione delle interazioni di surface plasmon resonance (SPR)23 e radiolabeling per emissione di positroni di positroni (PET)24.
Ad oggi, sono stati pubblicati oltre 25 diverse LCOs con. Un maggiore uso di LCOs per l'imaging dei giacimenti di amiloide aumenterà la conoscenza e la comprensione di come questi aggregati di malattia-collegati montare, smontare e interferiscano con gli organi e gli individui in cui risiedono.

Deposizione di amiloide nel tessuto è un marchio di garanzia patologico in un numero malattie come il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, amiloidosi sistemica e malattie da prioni. Nonostante la prevalenza di malattie amiloide-relativi e il fatto che quasi 40 diverse proteine fino ad oggi sono stati classificati come precursori dell'amiloide in umano1, piccolo è conosciuto circa la relazione tra il deposito dell'amiloide e il fenotipo della malattia. L'istologia dei campioni provenienti da pazienti umani è stato utilizzato sia per scopi diagnostici e scientifici. Un gran numero di modelli animali è stato istituito per studiare la correlazione tra onere dell'amiloide e comportamento, durata e un numero di altri lettura fenotipica outs di malattia progressione2,3. Grandi sforzi si fanno anche nel design per combattere alcuni dei nostri più temute malattie diffuse e scoperta di nuovi farmaci. Tuttavia, la valutazione del legame tra genotipo, fenotipo, carico della placca dell'amiloide e l'amministrazione di droga non è dritto in avanti. Gli strumenti per la colorazione e di imaging di amiloide nel tessuto hanno smussati e forniscono informazioni di bassa risoluzione sulla struttura e sulla formazione dell'amiloide.
Rosso Congo birifrangenza, ThT e ThS fluorescenza sono esempi di metodi classici per la rilevazione e l'analisi degli oneri dell'amiloide nei campioni di tessuto da biopsie di pazienti e post mortem campioni e modelli animali di malattia4. Queste tecniche sono state utilizzate per decenni (colore rosso di Congo dal 1920 e ThT e derivati dal 1960), e anche se la strumentazione è stata perfezionata e permette un'analisi dettagliata, ancora vengono eseguite le procedure di colorazione e analisi allo stesso modo come quasi un secolo fa.
In questo articolo, descriviamo l'utilizzo di un colorante di amiloide romanzo altamente sensibile, hFTAA5, che consente il rilevamento dei depositi di piccola proteina immaturo con alta precisione, come pure la rilevazione di amiloide maturo. Rispetto ai coloranti convenzionali, è stato dimostrato per rilevare una gamma più ampia di malattia associata proteina aggregati5,6,7hFTAA. Inoltre, hFTAA può anche applicarsi per assegnazione ottico di morfotipi aggregati distinti8. Qui, descriviamo la macchiatura di hFTAA e l'analisi del tessuto da affermati modelli animali di malattia da prioni e β-amiloide Precursor Protein (APP) topi transgenici progettata per imitare lo sviluppo della placca nella malattia di Alzheimer9,10 . Mostriamo anche analisi di diagnostica e post mortem campioni da pazienti affetti da amiloidosi sistemica. La LCOs hanno proprietà intrinseche che consente loro di riferire sulle differenze conformazionali all'interno di una placca; e combinando due LCOs con caratteristiche diverse per quanto riguarda l'associazione e fluorescenza, la differenza è ancora più pronunciata11. Un microscopio a epifluorescenza dotato di filtri di passaggio lungo e una testa di macchina fotografica iperspettrale viene utilizzata per consentire la classificazione oggettiva delle proprietà spettrali e la registrazione delle micrografie per analisi spettrale. Microscopia di fluorescenza confocale con un laser sintonizzabile come la sorgente di eccitazione viene utilizzata per valutare le proprietà tridimensionale di una placca amiloide in maggiore dettaglio. Il laser sintonizzabile consente la raccolta di spettro di eccitazione e un passo meno selezione delle lunghezze d'onda di emissione il microscopio permette di co-formazione immagine di fluorescenza LCO e immunofluorescenza per determinare co-localizzazione della proteina dell'obiettivo e dell'amiloide. FLIM offre inedita sensibilità alle differenze conformazionali inflitta la LCOs e rivela differenze che potrebbero non essere rilevate sullo spettro di emissione di fluorescenza.
Gli obiettivi principali con il metodo di colorazione descritto sono di facilitare la rivelazione sensibile di piccoli depositi di amiloide e di caratterizzare polimorfismo conformazionale all'interno di depositi di amiloide. Questa conoscenza è importante per la comprensione di base di malattie di aggregazione di proteine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>hFTAA/Amytracker545</td>
			<td>Ebba Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako fluorescene mounting medium</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>GM304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LeicaDM6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumen 200</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectraview system</td>
			<td>ASI spectral imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectraview software</td>
			<td>ASI spectral imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM780</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2010b v6.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIM system</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar/ML 458/488/514</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunable Laser In Tune</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging amyloid tissues stained with luminescent conjugated oligothiophenes by hyperspectral confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging

Proteine che al deposito dell'amiloide in tessuti in tutto il corpo può essere la causa o la conseguenza di un gran numero di malattie. Tra questi troviamo le malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e di Parkinson che affligge principalmente il sistema nervoso centrale e amiloidosi sistemica come amiloide nel fegato, carpale dove depositare i amiloide A del siero, transthyretin e catene chiare di IgG tunnel, milza, rene, cuore e altri tessuti periferici. Amiloide è stato conosciuto e studiato per più di un secolo, spesso utilizzando coloranti specifici dell'amiloide come colore rosso di Congo e Tioflavina T (ThT) o Thioflavin (ThS). In questa carta, presentiamo heptamer-formile tiofene acido acetico (hFTAA) come esempio di complementi recentemente sviluppati per questi coloranti chiamati luminescenti oligotiofeni coniugati (LCOs). hFTAA è facile da usare ed è compatibile con la co-macchiatura in immunofluorescenza o con altri markers cellulari. Approfondite ricerche ha dimostrato che hFTAA rileva una vasta gamma di aggregati proteici di malattia associata che convenzionale coloranti dell'amiloide. Inoltre, hFTAA può anche applicarsi per assegnazione ottico di morfotipi distinti aggregati per consentire studi di polimorfismo della fibrilla dell'amiloide. Mentre la metodologia di formazione immagine applicata è facoltativa, abbiamo qui dimostrano l'imaging iperspettrale (HIS), microscopia confocale e durata di fluorescenza (FLIM) di imaging laser. Questi esempi mostrano alcune delle tecniche di imaging dove LCOs possono essere utilizzati come strumenti per acquisire una conoscenza più dettagliata della formazione e proprietà strutturali di amiloidi. Una limitazione importante alla tecnica è, come per tutte le tecniche di microscopia ottica convenzionale, il requisito di dimensioni microscopiche di aggregati per consentire il rilevamento. Inoltre, l'aggregato dovrebbe comprendere una struttura ripetitiva di β-foglio per consentire per l'associazione hFTAA. Eccessiva esposizione di fissazione e/o epitopo che modificano la struttura aggregata o conformazione può render poveri hFTAA associazione e quindi porre limitazioni all'accurato imaging.

Sensibile e selettiva la colorazione dei depositi di amiloide da un gran numero di proteine in molti diversi tipi di tessuto da pazienti umani e animali da esperimento è vitale per la diagnostica clinica così come nella ricerca scientifica. In questa carta, dimostriamo come questo può essere raggiunto utilizzando LCOs, esemplificato dal hFTAA, per la colorazione e imaging multimodale di amiloide da una selezione di tipi di tessuto. Sin dalla prima pubblicazione di tiofene-basato dell'amiloide ligandi più di dieci anni fa13, amiloide depositi composti da un'ampia gamma di proteine in una varietà di tessuti sono stati Imaging utilizzando LCOs6,7,11, 14,15,16 (Figura 1). In combinazione con anticorpi o altri marcatori istologici, la LCOs fornire ottimi strumenti per scopi diagnostici sia scientifici (Figura 1a, Figura 2). Con un'appropriata selezione dei marcatori fluorescenti, fluorofori diversi possono essere imaged sulla stessa sezione (Figura 1a, hFTAA e DAPI, Figura 2a hFTAA nel setup di immunofluorescenza). È anche possibile utilizzare sezioni consecutive per la macchiatura utilizzando il campo chiaro e fluorescenza (Figura 2b, hFTAA e DAB macchiatura dell'anticorpo). Recentemente, hFTAA ha dimostrato di essere un complemento molto promettente al rosso Congo colorazione diagnostica clinica7,15 (Figura 3).
Sviluppo di tecniche di imaging negli ultimi decenni ha aumentato la necessità di amiloide coloranti che possono discriminare tra minuti, ma le stesse differenze di tempo profonda in depositi di amiloide in maniera quantitativa. Il sistema coniugato all'interno il LCO fornisce una capacità unica di relazione sulla variazione nella sua modalità di associazione. Torsione della molecola può condurre ad una distorsione negli angoli associazione nel sistema coniugato e ostacolare il trasporto di elettroni (Figura 4a). Questo a sua volta riflette sulle proprietà fluorescenti di LCO durata di emissione sia in lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione. Usiamo la sua in un microscopio a fluorescenza verticale dotato di filtri di passaggio lungo per l'emissione. Per eccitazione e spettri di emissione in microscopia confocale e FLIM, usiamo un LSM780 con laser pulsato. Per esemplificare le diverse tecniche, abbiamo ripreso un oggetto (la placca beta amiloide (Aβ) in un topo transgenico APP) (Figura 4b–e). Spettri di fluorescenza iperspettrale (Figura 4b) consente la valutazione di shift spettrali e variazione di intensità all'interno di diverse regioni della placca. Spettro di eccitazione in microscopia confocale (Figura 4c) può essere utilizzato per determinare la lunghezza d'onda di eccitazione ottimale per esperimenti a valle, ad es., combinazione di macchiatura con diversi fluorofori. Questo metodo può rivelarsi utile per il rilevamento delle differenze conformazionali nella modalità di associazione del LCO. Spettro di emissione nella modalità confocale può essere utilizzato per determinare le proprietà di emissione di fluorescenza da hFTAA o da una combinazione di diversi fluorofori per valutare colocalizzazione negli esperimenti di combinazione con diversi LCOs o LCO e immunofluorescenza combinazioni. La durata di fluorescenza di hFTAA è fortemente influenzata da piccole variazioni nella modalità di associazione di hFTAA. Quindi FLIM è uno strumento potente nel discriminare tra le differenze imposte hFTAA dalla destinazione dell'associazione (Figura 4D). Questo consente ad esempio la discriminazione tra prionica diversi ceppi8. Imaging confocale e trasformazione Z-stack in immagini tridimensionali è uno strumento utile per esplorare la forma complessiva di un'aggregazione amiloide (Figura 4e). Ancora una volta, l'uso di ulteriori fluorofori possa aiutare a comprendere la composizione di un deposito.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig1.jpg"> 
Figura 1: vari tipi e proteine aggregati tessuto risultati h-Alca macchiatura di: (una) Mallory-Denk corpi costituiti da aggregati di cheratina in un fegato (controcolorati con DAPI), inclusioni p62-positivo r (b) in sporadici corpo di inclusione miosite (s-IBM) tessuto muscolare, (c), amiloide del polipeptide amiloide isolotto nel pancreas umano, del cervello (d), della catena chiara dell'amiloide di immunoglobulina nell'intestino umano, (e), Sheep scrapie (prioni) nel topo, (f ) Cronica malattia (prioni) nel cervello di topo, (g), Aβ placche nel cervello di topo di APP23, di spreco (h), Aβ patologia nel cervello di topo APP/PS1 e la biopsia (io) grasso strisci da campioni diagnostici di amiloide da transtiretina nei pazienti umani graduata 1-4 secondo standard rosso Congo (CR) segnando. Aree gialle mostrano hFTAA macchiato i giacimenti di amiloide e blu è autofluorescence dal tessuto adiposo. La lunghezza della barra di scala è specificata in ogni pannello. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig2.jpg"> 
Figura 2: esempi di co-macchiando con gli anticorpi. (un) Co-colorazione con anti-siero proteina dell'amiloide A (AA) immunofluorescenza e hFTAA di umano amiloide AA sulla stessa sezione. In alto a sinistra: AA anticorpo emissione 640 nm; hFTAA superiore destra a 488 nm; mascherina del pannello di fondo colocalizzazione di mostrare immagini in giallo. (b), dell'anticorpo che macchia e hFTAA fluorescenza su sezioni consecutive. Pannello superiore: AA anticorpo DAB macchiatura, pannello inferiore: hFTAA imaged con un filtro di emissione longpass. Barra della scala: 100 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig3.jpg"> 
Figura 3: Confronto tra fluorescenza con filtri di passaggio corto transthyretin amiloide nel cuore umano macchiato ematossilina/Congo di Mayer rosso (un–d) con ematossilina/hFTAA di Mayer (e). (un) campo chiaro immagine, (b), campo chiaro, fluorescenza, (c), campo chiaro + polarizzatori incrociati, (d), campo chiaro + fluorescenza + polarizzatori incrociati, (e) hFTAA fluorescenza nel 405Nm + eccitazione di 480 nm (sezioni consecutive ad un–d). Barra della scala: 100 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig4.jpg"> 
Figura 4: lo stesso oggetto macchiato con hFTAA ed imaged con diverse tecniche è dimostrato utilizzando una piastra Aβ in un topo invecchiato di APP23. (un) la fluorescenza proprietà di hFTAA è dettato dal suo stato conformazionale. Struttura di hFTAA nello stato di planare e contorto è mostrata. (b) Hyperspectral imaging per la valutazione dello spettro di emissione continuo. Spettri nel pannello inferiore sono colore codificato secondo "in box" regioni di interesse nell'immagine. (c) (i) confocale imaging per l'imaging di eccitazione e spettro (ii e iii) e formazione immagine dell'emissione in modalità filtro o spettrale (iv). (d), fluorescenza formazione immagine di corso della vita per il rilevamento delle differenze conformazionali di amiloide, dove durate più brevi si trovano nella periferia della placca Aβ e i tempi di vita sono più al centro della placca. Istogramma nel pannello inferiore mostra la distribuzione dei tempi di vita per l'intera placca. L'immagine è di colore secondo la scala sotto l'istogramma. (e) dello stack Z confocale raccolti in modalità di filtro per visualizzare la struttura tridimensionale di oggetti. La lunghezza della barra di scala è specificata in ogni pannello. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Deposito dell'amiloide è un segno distintivo di diverse malattie e affligge molti organi diversi. Questo articolo descrive l'applicazione della fluorescenza luminescenti oligotiofenici coniugati macchiatura in combinazione con tecniche di microscopia di fluorescenza. Questo metodo di colorazione rappresenta un potente strumento per il rilevamento e l'esplorazione di aggregati proteici nelle configurazioni sia clinici che scientifici.

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Ricerca

Biochimica

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

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