Name: high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

تمويل الدعم لهذا المشروع قدمت منحة إلى همك "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (منح باتاكا 133473).

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

وقد المؤلف لا تضارب المصالح المالية.

ينص البروتوكول على وصف أسلوب استنساخه عالية وحساسة، واقتصادا للكشف عن معظم الكشف في الأنسجة أو أجنة المورفولوجية الثابتة. على الرغم من أن قليلاً أكثر تعقيداً مما الأكثر تقليديا تستخدم الأسلوب الفوسفاتيز القلوية للكشف عن التحقيق، أن القرار تم الحصول عليها من الأسماك أكبر بكثير والحساسية قابلة للمقارنة أو تحسين 7،8. باستخدام لوحات microtiter كاملة أو جزئية، يمكن استخدام البروتوكولات لتحليلات واسعة النطاق أو محدودة للجينات للفائدة. تجدر الإشارة إلى أن المجسات التي تم إنشاؤها يمكن الكشف عن كافة أو لصق نسخة متعددة الأشكال ما لم تكن مصممة على وجه التحديد المسابر (أي، واحد exons). على الرغم من اختبرناها المسابير صغيرة النيوكليوتيدات 200 بنجاح معقولة، تميل إلى أن تكون أقل فعالية المسابير أصغر وقد يكون أقل تحديداً. ومن الواضح أن هذا البروتوكول غير مناسب للكشف عن الصغيرة introns، exons، أو معالجة ميكرورناس.
على الرغم من أن هذا النهج يستخدم خطوة الانزيمية لتعزيز قوة الإشارات، يظهر كثافة إشارة يكون متناسباً مع الهدف التعبير الجيني في نطاق مستويات التعبير الخطي وواسع نسبيا. في أعلى التكبير، يعتبر الإشارة بونكتا أو تلامس داخل الخلايا والأنسجة. وينظر للنصوص نادرة نسبيا سوى عدد قليل من بونكتا صغيرة. كما يزيد من وفرة نسخة، وهذه تنمو في عدد وحجم. كما هو الحال مع جزيء واحد الأسماك (سمفيش)، بونكتا صغيرة واحدة قد تقابل أيضا الكشف واحدة وينبغي أيضا سهولة كمياً باستخدام برمجيات التصوير والمعلوماتية. مقارنات بين الصور المنشورة الحصول عليها باستخدام سمفيش مع الصور التي كنا قد رعاية للأهداف نفسها التي تشير إلى أن عموما وحساسية وحلها بالطريقتين متشابهة نسبيا، على الرغم من أن هذا ينبغي أن يمكن اختباره بواسطة مقارنات أكثر صرامة. الأسلوب المقدمة هنا نظراً لنفقات أعلى كثيرا من سمفيش، ينبغي أن تعطي نتائج مماثلة في جزء صغير من التكلفة. ومع ذلك، إذا كان الهدف الكشف عن النصوص الصغيرة، أو أجزاء منفصلة من النصوص، ينصح سمفيش.
نظراً لحجم أصغر من بعض المسابير الأسماك، قد يكون هذا الأسلوب أيضا أفضل في اختراق الأنسجة التي تكون كبيرة أو عقبات كبيرة. ومع ذلك، تظهر استخدامنا لمستويات أعلى من المنظفات والأنسجة من التثبيت وبيرميبيليزيشن من القرص حل هذه المشكلة. أخيرا، على الرغم من أن البلدان المتقدمة النمو للأنسجة المورفولوجية ، ينبغي أيضا العمل مخازن المنظفات عالية الموصوفة هنا لتشريح الأنسجة للأجنة المورفولوجية ، فضلا عن معظم الكائنات الحية والأنسجة الأخرى.

أساليب الكشف عن الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم جديدة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي توسعت إلى حد كبير معرفتنا متى وأين يتم التعبير عن الجينات، وإزاء ما مستويات1. ومع ذلك، توفر هذه القرار الزماني والمكاني فقيرة نسبيا. الجيش الملكي النيبالي في التهجين الموقع يسمح التوزيع المكاني للنصوص التي سيحتفل بها بصريا في الأنسجة الثابتة، مما يكشف عن تفاصيل التعريب الخلوية وسوبسيلولار2. يسمح القرار المكانية أكثر كما أنه يسمح باستخدام تقنيات الفحص المجهري قوية، مثل ورقة [كنفوكل] والخفيفة الميكروسكوب3باستخدام التهجين في الموقع نيون (الأسماك). يمكن أيضا استخدام علامات مضيئة مثل DAPI إقامة علاقات سوبسيلولار4. الأسماك يسهل أيضا الملاحظة للكشف والبروتينات متعددة في وقت واحد مع مؤشرات واضحة للتداخل على مستوى سوبسيلولار. ويمكن الاطلاع على الكواشف فريدة من نوعها والخطوات اللازمة لوضع العلامات المزدوجة في المراجع التالية3،5.
تعمل الإجراءات الموضحة هنا تستخدم لوحات microtiter 96-جيدا لجميع الخطوات، بما في ذلك إنتاج قالب كدنا (مستعمرة PCR)، إنتاج مسبار الحمض النووي الريبي (باستخدام النسخ بوليميريز-تعتمد على الجريان السطحي T7, T3 أو SP6)، التهجين في الموقع ، و وضع إشارة الفلورسنت. يتم إضافة عدد كاف من أجنة أو أنسجة لكل جيدا لصفيحة 96-جيدا للسماح بتقييم الاتساق وتقلبه. ويتلقى كل جيدا ثم تحقيق مختلفة. بعد وضع إشارة، هي صفت أجنة أو أنسجة من كل بئر على شرائح المجهر الفردية للتحليل المجهري.
استخدام التضخيم إشارة تيراميدي (TSA) لكشف المسبار تنتج إشارات قوية مع قرار استثنائي سوبسيلولار 5،6،،من78. تعريب سوبسيلولار للكشف هو إليه تنظيمية هامة 9 التي يبدو أن يحدث مع تقريبا جميع الكشف 4،،من1011. وأظهرت هذه التحليلات أيضا أن العديد من النصوص التي لم يتم الكشف عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي هي سهولة الكشف عن الأسماك 8. تكييف الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين إلى لوحات 96-جيدا يسمح تحليل الجينات تصل إلى 96 من الفائدة في كل مرة (وتستخدم لوحات أكثر إذا إضافية)، مما يجعل من الممكن تحليل مجموعات البيانات الكبيرة. قطع اللوحات إلى مقاطع أصغر، تتكيف الأسلوب أيضا بسهولة عينات قليلة فقط. وينص البروتوكول المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي لتوزيع في معظم أنواع الأنسجة. على الرغم من أن لا يظهر، أنها قابلة للتكيف لغير-المورفولوجية الأنسجة، وكذلك.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td>
			<td>Biomart (Canada)</td>
			<td>141106-1K</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>MSBVS1210</td>
			<td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate (200 &#956;l)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C18096-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH&#8322;O and 0.2&#956;m filtered (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P96-450V-C</td>
			<td>To store bacterial glycerol stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-PCR-AS-200</td>
			<td>To seal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-T205-WB-C</td>
			<td>To transfer samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>200062156</td>
			<td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &#956;g/ml or 1/400 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td>
			<td>BrandTech Scientific Inc.</td>
			<td>704526</td>
			<td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&#956;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2522</td>
			<td>Antifade reagent in mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Working concentration is 0.1 % in ddH&#8322;O. To make RNase free water 0.1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-uridine-5&#8217;-triphosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-209-256-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5804</td>
			<td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>FOR001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY002.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>DiaMed</td>
			<td>LAA42370-001</td>
			<td>Fill in heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-347</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 100 micons</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>57-103</td>
			<td>For collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 800 microns</td>
			<td>SEFAR - Nytex</td>
			<td>06-780/53</td>
			<td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>Size: 22 X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slides,frstd</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Size: 25 X 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>P/N 5017</td>
			<td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PAR070.500</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model: DNA Engine PTC-200</td>
			<td>96-well plate PCR and probe denature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picric acid solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>80456</td>
			<td>For tissue fixation I solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCL)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH&#8322;PO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PPM302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P-LID-PP</td>
			<td>Lid for storing plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>825-1-50-5S</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>87-CFILM-AL</td>
			<td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P2308- 5MG</td>
			<td>Embryo permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977015-500ml</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Remove RNase contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single stranded DNA from salmon testes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D9156</td>
			<td>For hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk (non fat power)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SKI400.500</td>
			<td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA333</td>
			<td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (HOC(COONa)(CH&#8322;COONa)&#8322; &#183; 2H&#8322;O</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td>Reagent in 20 X SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na&#8322;HPO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.1</td>
			<td>Reagent in 10 X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0131</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259-274.</td>
			<td>To fill the heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope &#38; gooseneck light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ6</td>
			<td>Tissue dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S911</td>
			<td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &#956;g/ml) for in situ.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0101</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0111</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (10 ul)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-STK-S</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (200 ul)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>27770T</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips ( 1ml)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>10200</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TRX506</td>
			<td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHA1003917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH&#8322;O (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH&#8322;O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (80 g), KCL (2 g), Na&#8322;HPO&#8324; (14.4 g), KH&#8322;PO&#8324; (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

في جهودنا الرامية إلى تحديد أنماط التعبير والتعريب سوبسيلولار من المورفولوجية الكشف على نطاق الجينوم، وفي مجموعة متنوعة من الأنسجة، قمنا بتطوير العديد من التعديلات والتحسينات على موقعنا الأصلي فلوري في الموقع البروتوكول التهجين (الأسماك). لتسهيل الإنتاجية وفعالية التكاليف، جميع الخطوات، من جيل التحقيق للكشف عن إشارة، يتم تنفيذها باستخدام لوحات microtiter 96-جيدا إكسون. ديجوكسيجينين (حفر)-تحقيقات المسمى antisense الحمض النووي الريبي يتم إنتاجها باستخدام الحيوانات المستنسخة كدنا أو الحمض النووي كقوالب. بعد تثبيت الأنسجة وبيرميبيليزيشن، هي تهجين المسابير للمحاضر الحرفية للفائدة وتم الكشف عنها باستخدام سلسلة الأجسام المضادة حفر مترافق ثم إلى البيوتين، streptavidin مترافق بالفجل البيروكسيديز (HRP) وفلوريسسينتلي مترافق تيراميدي، التي تنتج متوسط شدة رد الفعل الذي يربط بين المناطق الكثيفة إلكترون من البروتينات متاخم حضور برنامج الصحة الإنجابية،. تنتج هذه الخطوات التضخيم والتعريب إشارة قوية وعالية مترجمة يسهل الترجمة نسخة الخلوية وسوبسيلولار على حد سواء. لقد تم تحسين البروتوكولات المقدمة لإنتاج إشارات محددة للغاية في مجموعة متنوعة من الأنسجة ومراحل النمو. كما تتوفر المراجع للتغيرات الإضافية التي تسمح للكشف عن العديد من النصوص، أو النصوص والبروتينات، متزامنة في نفس الوقت.

ويبين الشكل 6 أمثلة على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء. لوحات 3 الأعلى إظهار أمثلة المبكر المورفولوجية الأجنة (الشكل 6، لوحات أ-ج)، 3 المقبل لوحات أمثلة في وقت متأخر الأجنة المورفولوجية مع إشارات في أنسجة مختلفة (أمنيوسيروسا والعضلات والجهاز العصبي المركزي، على التوالي (الشكل 6، ألواح د-F). التالية هي أمثلة من الطور الثالث الأنسجة اليرقات (الشكل 6، ولوحات ز-ي). لوحات K و L تظهر الصور التمثيلية من الكبار الغدد التناسلية (المبيض والخصية، على التوالي). تم تحميله مئات الصور والمشروح في جهودنا للبحث 'الفلورسنت في الموقع ذبابة الفاكهة قاعدة البيانات' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
الشكل 1. الخطوط العريضة الفلورسنت في الموقع التهجين (الأسماك) البروتوكول ومفتاح المعدات. (أ) [بكر] تضخيم لكدنا. (ب) النسخ في المختبر لتوليد حفر العقاقير الخاصة بالجينات-المسمى تحقيقات الجيش الملكي النيبالي في صفيحة 96-جيدا (صورة للوحة سيظهر في ب). (ج) و (د): الكبار (الإناث: نسبة الذكور 2:1. 300-400 الذباب/زجاجة) الذباب ويسمح لزميله لمدة 3-4 أيام. يتم نقل الأجنة من مجموعة بين عشية وضحاها على معيار دقيق الذرة الغذاء عند 25 درجة مئوية إلى علبة بلاستيكية جيدة التهوية (1 لتر من دقيق الذرة الغذاء في حاوية الحجم: 8 "× 8" X 3 "LWH) أو في زجاجات جديدة الحفاظ على كثافة يرقات سليمة. لجمع الأنسجة، ويجب أن يرش مسحوق الخميرة النشطة على قمة الغذاء في 24، ح 48 بعد بيضة زرع (AEL). (E إلى H): فلوري في الموقع تجارب التهجين إجراء أكثر من 3 أيام متتالية. للأجنة أو الأنسجة التي لا تطفو، استخدام لوح بكر 96-جيدا كما هو موضح في الصورة ب مع 8 قنوات الشافطة (صورة ج). للأنسجة التي تطفو، مثل معظم أنسجة اليرقات، استخدام لوحة تصفية القاع (الصورة في د) وإزالة السائل من الأسفل مع المضخة متعددة استخدام ضغط منخفض (الصورة في ه). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
رقم 2. تحديد العائد مسبار الحمض النووي الريبي. حديثا توليفها المسابير antisense الحمض النووي الريبي يحتفل في 1% [اغروس] هلام (5 ميليلتر في حارة). ويمكن تصنيف العائد (استناداً إلى كثافة الفرقة) 'منخفضة الغلة' في الممرات 3 و 10، 'عائد نموذجي' في الممرات 1، 4، 5، 6 و 8، أو 'عالية الغلة' في الممرات 2، 7، 9 و 11 و 12. لعينات مع 'غلة نموذجية'، استخدم 10-15 ميليلتر من مسبار المخفف في 100 ميليلتر من التهجين الحل لكل تجربة في الموقع . تمييع عينات مع 'غلة عالية' للتحقيق مع الحل التهجين إضافية وفقا لكثافة الفرقة بالنسبة كثافة 'تحقيق نموذجية'. وتهدف إلى أن تركيزات التحقيق النهائي متساوية تقريبا في كل بئر. يشير السهم إلى واحدة من 'تحقيقات الجيش الملكي النيبالي،' الفرقة أعلى في كل حارة هو قالب الحمض النووي الأصلي. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
الشكل 3. الرئيسية خطوات لجمع الجنين على نطاق واسع والتثبيت- <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
الشكل 4. أنبوب محلية الصنع لإزالة السائل من أنسجة اليرقات أو عائم. تعويم بعض الأنسجة اليرقات والكبار في الحل أثناء التثبيت. هذه أداة بسيطة تتألف من شبكة النايلون عقدته 200 ميليلتر قطع الحافة، تليها تلميح 1 مل كمحول للاتصال المضخة. سائل يمكن إزالتها بأمان دون أن تفقد أي الأنسجة. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
الرقم 5. تضخيم الإشارات تيراميدي. (1) حفر المسمى مسبار الحمض النووي الريبي العقاقير هيبريديزيس مع الإحساس بالذاتية الجيش الملكي النيبالي. (2) المناعية-تقارب ملزم بين جسم الابتدائي مترافق البيوتين وحفر UTP. (3) برنامج الصحة الإنجابية مترافق streptavidin يربط البيوتين. (4) برنامج الصحة الإنجابية يحفز cyanine 3-تيراميدي، وفوق أكسيد الهيدروجين رد فعل لتشكيل الجذور 3-تيراميدي سيانيني لم تدم طويلاً. (5) سيانيني 3-تيراميدي الجذور ربط تيروزين المخلفات على البروتينات القريبة. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
الشكل 6. الممثل في الموقع الصور التهجين. كل لوحة يظهر مثال الحمض النووي الريبي مختلفة (كما هو موضح في سماوي) ونوى ملطخة DAPI (يظهر باللون الأحمر). (أ-ج) أمثلة للأجنة المورفولوجية في وقت مبكر. (D, F) أمثلة من أواخر المورفولوجية الأجنة. (غ-ي) أمثلة من 3rd instar المورفولوجية اليرقات الأنسجة (مالفيجيان الأنابيب، الأمامي والغدة اللعابية وعضلة على التوالي). (ك) الكبار المبيض. (L) الخصية الكبار. تعرض كل لوحة اسم جين أن التحقيق هو التهجين إلى. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

الجيش الملكي النيبالي هو موضح في الموقع البروتوكول التهجين يسمح الكشف عن الحمض النووي الريبي في أسرة المورفولوجية أجنة أو أنسجة تشريح. استخدام لوحات microtiter 96-جيدا وتضخيم إشارة تيراميدي، يمكن اكتشاف النصوص في عالية الدقة والحساسية، والإنتاجية، وتكلفة منخفضة نسبيا.

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

في الموقع وصفها من الحمض النووي النسخ المتماثل في ذبابة الفاكهة الكبار المبايض عن طريق ايدو تلطيخ

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

استخدام "واحد جزيء فلوري في الموقع التهجين" (SM-الأسماك) إلى مرناس Quantify و Localize في "بويضات مورين"

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

تهجين في الموقع كروميجيني في أداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة ذات الصلة بفيروس الورم الحليمي البشري

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

تصميم الألى ، عاليه الانتاجيه ، والمستمر تجارب نمو الخلايا باستخدام ايفولفير

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...