Name: high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

Financiering van de steun voor dit project werd verstrekt door een subsidie aan HMK door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen MOP 133473).

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Het beschreven protocol biedt een zeer reproduceerbaar, gevoelige en economische methode voor de detectie van de meeste RNAs in vaste Drosophila embryo's of weefsels. Hoewel iets ingewikkelder dan de meer traditioneel alkalische fosfatase methode voor de detectie van de sonde gebruikt, de resolutie verkregen door vis is veel groter en de gevoeligheid is vergelijkbare of betere 7,8. Met behulp van gehele of gedeeltelijke microtiterplaat platen, kunnen de protocollen worden gebruikt voor grootschalige of beperkte analyses van genen van belang. Opgemerkt moet worden dat de sondes gegenereerd kunnen alle gedetecteerd of meerdere transcript splice vormt tenzij sondes zijn meer specifiek ontworpen (dat wil zeggen, één exons). Hoewel we hebben getest sondes zo klein als 200 nucleotiden met redelijk succes, kleinere sondes zijn meestal minder effectief en kunnen wel minder specifiek zijn. Duidelijk, is dit protocol is niet geschikt voor het opsporen van kleine introns, exons, of microRNAs verwerkt.
Hoewel deze aanpak een enzymatische stap gebruikt voor het stimuleren van de sterkte van de signalen, lijkt signaalsterkte te zijn in verhouding tot doel genexpressie in een relatief lineaire en brede waaier van expressie niveaus. Op hogere vergroting, het signaal wordt gezien als puncta of spikkels binnen cellen en weefsels. Alleen een paar kleine puncta zijn relatief zeldzaam afschriften beschouwd. Zoals transcript overvloed toeneemt, groeien deze in aantal en de grootte. Zoals met enkel molecuul vis (smFISH), enkele kleine puncta mogelijk ook overeen met één RNAs en moet ook worden gemakkelijk gekwantificeerd aan de hand beeldvorming en informatica software. Vergelijkingen van gepubliceerde beelden verkregen met behulp van smFISH met beelden die we hebben samengesteld voor dezelfde doelstellingen suggereren dat de overall, de gevoeligheid en de resolutie van de twee methoden relatief vergelijkbaar, zijn maar dit moet worden getest door strengere vergelijkingen. Gezien de veel hogere kosten van smFISH, moet de methode die hier geven vergelijkbare resultaten tegen een fractie van de kosten. Maar als het doel is om het detecteren van kleine afschriften of afzonderlijke delen van afschriften, wordt smFISH aangeraden.
Vanwege de kleinere omvang van sommige vis sondes, kan deze methode ook worden beter op indringende weefsels die zijn grote of belangrijke belemmeringen. Echter, het gebruik van hogere niveaus van wasmiddel en weefsel fixatie en permeabilization tweaks lijken te hebben dit probleem opgelost. Tot slot, hoewel ontwikkeld voor Drosophila weefsels, de hoge wasmiddel buffers hier beschreven voor ontleed weefsels zou ook moeten werken voor Drosophila embryo's, evenals de meeste andere organismen en weefsels.

Nieuwe genoom-brede RNA detectiemethoden zoals RNA-seq hebben onze kennis van wanneer en waar de genen worden uitgedrukt, en op welke niveaus1sterk uitgebreid. Deze bieden echter relatief lage temporele en ruimtelijke resolutie. RNA in situ hybridisatie kunt de ruimtelijke spreiding van afschriften worden visueel waargenomen in vaste weefsels, aldus onthullen de details van cellulaire en subcellular localisatie2. Gebruikt Fluorescente kruising in situ (vissen), kunt zelfs meer ruimtelijke resolutie als daarmee het gebruik van krachtige microscopie technieken, zoals confocale en lichte blad microscopie3. Fluorescente markeringen zoals DAPI kunnen ook worden gebruikt om vast te stellen subcellular relaties4. VIS vergemakkelijkt ook de observatie van meerdere RNAs en eiwitten gelijktijdig met duidelijke aanwijzingen van overlap op het subcellular niveau. Unieke reagentia en stappen die nodig zijn voor het labelen van dubbele kunnen worden gevonden in de volgende verwijzingen3,5.
De hier beschreven procedures gebruiken 96-wells microtiterplaat platen voor alle maatregelen, met inbegrip van cDNA sjabloon productie (PCR van de kolonie), RNA sonde productie (met T7, T3 of SP6 polymerase-afhankelijke run-off transcriptie), in situ hybridisatie, en fluorescent signaal ontwikkeling. Voldoende aantal embryo's of weefsels worden toegevoegd aan elk van de 96-wells-plaat om evaluatie van de consistentie en veranderlijkheid. Nou dan ontvangt elk een verschillende sonde. Na signaal ontwikkeling, zijn embryo's of weefsels van elk putje gekleed op individuele Microscoop dia's voor microscopische analyse.
Het gebruik van tyramide signaal versterking (TSA) voor de detectie van de sonde produceert robuuste signalen met uitzonderlijke subcellular resolutie 5,,6,,7,8. De subcellular localisatie van RNAs is een belangrijke regelgevende mechanisme 9 die verschijnt optreden bij vrijwel alle RNAs 4,10,11. Deze analyses hebben ook aangetoond dat veel afschriften die niet worden gedetecteerd door RNA-seq gemakkelijk worden gedetecteerd door vis 8. De aanpassing van RNA in situ hybridisatie aan 96-wells-platen kunt analyse van maximaal 96 genen van belang op een moment (meer als extra platen worden gebruikt), analyse van grote datasets mogelijk te maken. Door het snijden van de platen in kleinere delen, is de methode ook gemakkelijk aangepast aan een paar monsters. Het protocol geboden is geschikt voor analyse van RNA distributies in de meeste soorten weefsels. Hoewel niet wordt weergegeven, is het aan te passen aan niet -Drosophila weefsels zo goed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td>
			<td>Biomart (Canada)</td>
			<td>141106-1K</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>MSBVS1210</td>
			<td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate (200 &#956;l)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C18096-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH&#8322;O and 0.2&#956;m filtered (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P96-450V-C</td>
			<td>To store bacterial glycerol stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-PCR-AS-200</td>
			<td>To seal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-T205-WB-C</td>
			<td>To transfer samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>200062156</td>
			<td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &#956;g/ml or 1/400 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td>
			<td>BrandTech Scientific Inc.</td>
			<td>704526</td>
			<td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&#956;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2522</td>
			<td>Antifade reagent in mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Working concentration is 0.1 % in ddH&#8322;O. To make RNase free water 0.1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-uridine-5&#8217;-triphosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-209-256-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5804</td>
			<td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>FOR001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY002.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>DiaMed</td>
			<td>LAA42370-001</td>
			<td>Fill in heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-347</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 100 micons</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>57-103</td>
			<td>For collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 800 microns</td>
			<td>SEFAR - Nytex</td>
			<td>06-780/53</td>
			<td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>Size: 22 X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slides,frstd</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Size: 25 X 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>P/N 5017</td>
			<td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PAR070.500</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model: DNA Engine PTC-200</td>
			<td>96-well plate PCR and probe denature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picric acid solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>80456</td>
			<td>For tissue fixation I solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCL)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH&#8322;PO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PPM302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P-LID-PP</td>
			<td>Lid for storing plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>825-1-50-5S</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>87-CFILM-AL</td>
			<td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P2308- 5MG</td>
			<td>Embryo permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977015-500ml</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Remove RNase contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single stranded DNA from salmon testes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D9156</td>
			<td>For hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk (non fat power)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SKI400.500</td>
			<td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA333</td>
			<td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (HOC(COONa)(CH&#8322;COONa)&#8322; &#183; 2H&#8322;O</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td>Reagent in 20 X SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na&#8322;HPO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.1</td>
			<td>Reagent in 10 X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0131</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259-274.</td>
			<td>To fill the heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope &#38; gooseneck light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ6</td>
			<td>Tissue dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S911</td>
			<td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &#956;g/ml) for in situ.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0101</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0111</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (10 ul)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-STK-S</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (200 ul)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>27770T</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips ( 1ml)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>10200</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TRX506</td>
			<td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHA1003917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH&#8322;O (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH&#8322;O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (80 g), KCL (2 g), Na&#8322;HPO&#8324; (14.4 g), KH&#8322;PO&#8324; (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

In onze inspanningen om de patronen van meningsuiting en subcellular localisatie van Drosophila RNAs op basis van de genoom-brede en in een verscheidenheid van weefsels, hebben we talloze aanpassingen en verbeteringen aan onze oorspronkelijke TL in situ protocol van hybridisatie (FISH). Ter vergemakkelijking van doorvoer en kosteneffectiviteit, zijn alle stappen, van sonde generatie op signaal detectie, uitgevoerd met behulp van de exon 96-wells microtiterplaat platen. Digoxygenin (DIG)-gelabelde antisense RNA sondes worden geproduceerd met behulp van cDNA klonen of genomic DNA als sjablonen. Na weefsel fixatie en permeabilization, sondes worden gekruist om afschriften van belang en vervolgens gevonden met behulp van een opeenvolging van anti-DIG antilichaam geconjugeerd met biotine, daar geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) en fluorescently geconjugeerd tyramide, die in het bijzijn van HRP, produceert een zeer reactief intermediair dat zich bindt aan elektron dichte regio's van de onmiddellijk aangrenzende eiwitten. Versterking en localisatie volgt produceren een robuust en sterk gelokaliseerde signaal dat beide transcript van cellulaire en subcellular localisatie wordt vergemakkelijkt. De protocollen die zijn geoptimaliseerd voor de productie van zeer specifieke signalen in een verscheidenheid van weefsels en ontwikkelingsstadia. Verwijzingen zijn ook voorzien van extra variaties waarmee de simultane detectie van meerdere afschriften, of afschriften en eiwitten, op hetzelfde moment.

Figuur 6 ziet u voorbeelden van de resultaten verkregen met behulp van deze procedure. De top 3 panelen tonen voorbeelden van vroege Drosophila embryo's (Figuur 6, panelen A-C), de volgende 3 panelen voorbeelden van late Drosophila embryo's met signalen in verschillende weefsels (amnioserosa, spieren en centrale zenuwstelsel, respectievelijk (Figuur 6, panelen D-F). Volgende zijn voorbeelden van 3de instar larvale weefsels (Figuur 6, panelen G-J). Panelen K en L Toon representatieve beelden uit volwassen gonaden (eierstokken en testis, respectievelijk). Honderden foto's zijn geüpload en geannoteerde in onze doorzoekbaar 'fluorescent in situ fruitvlieg database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Figuur 1. Overzicht van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) protocol en sleutel apparatuur. (A) PCR versterking van cDNA. (B) In vitro transcriptie voor het genereren van gen-specifieke antisense DIG - label RNA sondes in een 96-wells-plaat (foto van de plaat weergegeven in b). (C) en (D): volwassenen (vrouwelijke: mannelijke verhouding 2:1. 300-400 vliegen/fles) vliegen zijn toegestaan om te paren voor 3-4 dagen. Embryo's uit een overnachting collectie op standaard maïsmeel voedsel bij 25 ° C worden overgebracht naar een goed geventileerde plastic doos (1 L voor Maïsmeel food in een container formaat: 8 "X 8" X 3" LWH) of om nieuwe flessen houden van een goede larvale dichtheid. Voor weefsel collectie, moet actieve gist poeder worden bestrooid op de top van het voedsel op 24, 48 h na ei leggen (AEL). (E tot H): Fluorescent in situ hybridisatie experimenten uitgevoerd meer dan 3 opeenvolgende dagen. Voor embryo's of weefsels die doen niet zweven, door een 96-Wells PCR plaat te gebruiken zoals in de foto b met 8-kanaals aspirator (foto c). Voor weefsels die, zoals de meeste larvale weefsels zweven, gebruik van een filter-bodem plaat (foto in d) en vloeistof afzuigen van bodem met een spruitstuk aspirator met behulp van lage druk (foto in e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figuur 2. Bepaling van RNA sonde opbrengst. Nieuw gesynthetiseerd antisense RNA sondes waargenomen op een 1% agarose gel (5 µL/lane). De opbrengst kan worden gecategoriseerd (gebaseerd op de intensiteit van de band) als "laag rendement' in stegen 3 en 10, 'typische opbrengst' in rijstroken 1, 4, 5, 6 en 8 of 'high yield' in rijstroken 2, 7, 9, 11 en 12. Voor monsters met een 'typische opbrengst', gebruik 10-15 µL van sonde verdund in 100 µL van hybridisatie oplossing voor elk experiment in situ . Verdun monsters met 'hoge opbrengsten' van sonde met extra hybridisatie oplossing volgens de intensiteit van de band ten opzichte van een 'typische sonde' intensiteit. Willen hebben min of meer gelijk definitieve sonde concentraties in elk putje. De pijl wijst naar één van de sondes van RNA, de hogere band op elke baan is de oorspronkelijke DNA-sjabloon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figuur 3. Belangrijke stappen voor een grootschalige embryo's worden verzameld en fixatie. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figuur 4. Zelfgemaakte buis voor het verwijderen van de vloeistof uit de larvale of zwevende weefsels. Sommige larven en de volwassen weefsels zweven in oplossing tijdens fixatie. Deze eenvoudige tool bestaat uit een nylon gaas gehouden door een 200 µL wenk, gevolgd door een 1 mL tip als een adapter om verbinding met een aspirator te knippen. Vloeistof kan veilig worden verwijderd zonder het verliezen van een weefsel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figuur 5. Tyramide signaal amplificatie. (1) antisense RNA-sonde DIG-label hybridizes met endogene gevoel RNA. (2) Immuno-affiniteit binding tussen Biotine-geconjugeerde primair antilichaam en DIG-UTP. (3) HRP geconjugeerd streptavidine bindt biotine. (4) HRP katalyseert de cyanine 3-tyramide en waterstofperoxide reactie tot kortstondige cyanine 3-tyramide radicalen. (5) cyanine 3-tyramide radicalen binden aan tyrosine residuen op nabijgelegen eiwitten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Figuur 6. Vertegenwoordiger in situ hybridisatie beelden. Elk deelvenster ziet u een voorbeeld van een verschillende RNA (getoond in cyaan) en kernen gekleurd met DAPI (afgebeeld in het rood). (A-C) Voorbeelden van vroege Drosophila embryo's. (D, F) Voorbeelden van late Drosophila embryo's. (G-J) Voorbeelden van 3e instar Drosophila larvale weefsels (malphigian tubuli, middendarm, speekselklier en spier respectievelijk). (K) volwassen eierstok. (L) volwassen testis. Elk paneel bevat de naam van het gen dat de sonde is kwekers aan. Schaal bars = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...