Name: high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

Soutien pour ce projet a été financé par une subvention de HMK par les instituts de recherche en santé (subvention 133473 MOP).

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

Auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Le protocole décrit fournit une méthode hautement reproductible, sensible et économique pour la détection d’ARN la plupart dans des embryons de drosophile fixe ou les tissus. Bien qu’un peu plus compliqué que plus traditionnellement utilisé de méthode de phosphatase alcaline de détection de la sonde, la résolution obtenue par les poissons est beaucoup plus grande et la sensibilité est comparable ou meilleure 7,8. En utilisant tout ou partie des microplaques, les protocoles peuvent être utilisés pour des analyses à grande échelle ou limités de gènes d’intérêt. Il est à noter que les sondes générées peuvent détecter tous ou plusieurs épissure de transcription fait à moins que les sondes sont conçus plus spécifiquement (c'est-à-dire, seul exons). Bien que nous avons testé aussi petits que 200 nucléotides avec un succès raisonnable des sondes, sondes plus petites ont tendance à être moins efficace et peuvent être moins précis. De toute évidence, ce protocole n’est pas approprié pour la détection de petits introns, exons, ni transformées microARN.
Bien que cette approche utilise une étape enzymatique pour booster la force des signaux, intensité du signal semble être proportionnel à l’expression des gènes cible dans une gamme relativement large et linéaire des niveaux d’expression. Un grossissement plus élevé, le signal est considéré comme punctums ou mouchetures dans les cellules et les tissus. Relativement rares transcriptions seulement quelques examen minuscules sont considérés. Comme transcription abondance augmente, celles-ci croissent en nombre et en taille. Comme avec molécules simples poissons (smFISH), seul petit examen peut également correspondre à RNAs unique et doit également être facilement quantifiée à l’aide de logiciels d’imagerie et d’informatique. Comparaisons d’images publiées obtenues à l’aide de smFISH avec les images que nous avons organisée pour les mêmes objectifs suggèrent que la globalement, la sensibilité et la résolution des deux méthodes sont relativement similaires, même si cela doit être testé par des comparaisons plus rigoureuses. Compte tenu de la dépense beaucoup plus élevée de smFISH, la méthode proposée ici devrait donner des résultats similaires à une fraction du coût. Toutefois, si l’objectif est de détecter les petites transcriptions, ou des parties distinctes de transcriptions, smFISH est recommandé.
En raison de la petite taille de certaines sondes FISH, cette méthode peut également être meilleure en pénétrant les tissus qui sont grandes ou présentent des obstacles importants. Cependant, notre utilisation des niveaux plus élevés de détergent et tissus fixation et perméabilisation des réglages semblent avoir résolu ce problème. Enfin, bien que mis au point pour des tissus de drosophile , les tampons de détergent hautes décrites ici pour tissus disséqués devraient aussi fonctionner pour les tissus ainsi que plupart des autres organismes et des embryons de drosophile .

Nouvelles méthodes de détection de RNA pangénomique tels que RNA-seq ont considérablement élargi notre connaissance de quand et où les gènes sont exprimés, et à quels niveaux1. Cependant, ceux-ci fournissent relativement faible résolution spatiale et temporelle. RNA hybridation in situ permet la distribution spatiale des transcriptions à observer visuellement en tissus fixés, révélant ainsi les détails de localisation cellulaire et subcellulaire2. En utilisant l’hybridation in situ fluorescente (FISH) permet une résolution spatiale encore plus car il permet l’utilisation des techniques de microscopie puissant, comme la feuille confocale et lumière microscopie3. Des marqueurs fluorescents comme DAPI permet également d’établir des relations subcellulaire4. POISSON facilite également l’observation des multiples des ARN et des protéines en même temps que des indications claires des chevauchements au niveau subcellulaire. Réactifs uniques et les étapes requises pour le marquage double se trouvent dans les références suivantes3,5.
Les procédures décrites ici utilisent microplaques 96 puits pour toutes les étapes, y compris la production de modèle de cDNA (PCR sur colonie), production de sonde d’ARN (à l’aide de la transcription de ruissellement dépendante polymérase T7, T3 ou SP6), hybridation in situ , et développement de signal fluorescent. Un nombre suffisant d’embryons ou de tissus est ajouté à chaque puits de la plaque à 96 puits pour permettre une évaluation de la cohérence et de la variabilité. Eh bien, chacun reçoit une sonde différente. Après le développement du signal, des embryons ou des tissus provenant de chaque puits sont rangés sur lames de microscope individuels pour analyse microscopique.
L’utilisation d’amplification de signal tyramide (TSA) pour la détection de la sonde produit des signaux robustes avec une résolution exceptionnelle subcellulaire 5,6,7,8. La localisation subcellulaire des ARN est un mécanisme important de régulation 9 qui semble se produire avec pratiquement tous les ARN 4,10,11. Ces analyses ont également montré que les nombreuses transcriptions qui ne sont pas détectées par RNA-seq sont facilement détectées par poisson 8. L’adaptation de l’hybridation in situ RNA pour plaques 96 puits permet l’analyse de jusqu'à 96 gènes d’intérêt à la fois (plaques plus si supplémentaires sont utilisées), permettant l’analyse des grands ensembles de données. En découpant les plaques en plus petites sections, la méthode est également facilement adaptée aux quelques échantillons. Le protocole fourni est approprié pour l’analyse des distributions de RNA dans la plupart des types de tissus. Bien que non représenté, il est adaptable aux non - tissus dedrosophile ainsi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td>
			<td>Biomart (Canada)</td>
			<td>141106-1K</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>MSBVS1210</td>
			<td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate (200 &#956;l)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C18096-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH&#8322;O and 0.2&#956;m filtered (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P96-450V-C</td>
			<td>To store bacterial glycerol stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-PCR-AS-200</td>
			<td>To seal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-T205-WB-C</td>
			<td>To transfer samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>200062156</td>
			<td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &#956;g/ml or 1/400 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td>
			<td>BrandTech Scientific Inc.</td>
			<td>704526</td>
			<td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&#956;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2522</td>
			<td>Antifade reagent in mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Working concentration is 0.1 % in ddH&#8322;O. To make RNase free water 0.1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-uridine-5&#8217;-triphosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-209-256-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5804</td>
			<td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>FOR001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY002.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>DiaMed</td>
			<td>LAA42370-001</td>
			<td>Fill in heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-347</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 100 micons</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>57-103</td>
			<td>For collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 800 microns</td>
			<td>SEFAR - Nytex</td>
			<td>06-780/53</td>
			<td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>Size: 22 X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slides,frstd</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Size: 25 X 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>P/N 5017</td>
			<td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PAR070.500</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model: DNA Engine PTC-200</td>
			<td>96-well plate PCR and probe denature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picric acid solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>80456</td>
			<td>For tissue fixation I solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCL)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH&#8322;PO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PPM302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P-LID-PP</td>
			<td>Lid for storing plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>825-1-50-5S</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>87-CFILM-AL</td>
			<td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P2308- 5MG</td>
			<td>Embryo permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977015-500ml</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Remove RNase contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single stranded DNA from salmon testes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D9156</td>
			<td>For hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk (non fat power)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SKI400.500</td>
			<td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA333</td>
			<td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (HOC(COONa)(CH&#8322;COONa)&#8322; &#183; 2H&#8322;O</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td>Reagent in 20 X SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na&#8322;HPO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.1</td>
			<td>Reagent in 10 X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0131</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259-274.</td>
			<td>To fill the heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope &#38; gooseneck light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ6</td>
			<td>Tissue dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S911</td>
			<td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &#956;g/ml) for in situ.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0101</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0111</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (10 ul)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-STK-S</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (200 ul)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>27770T</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips ( 1ml)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>10200</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TRX506</td>
			<td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHA1003917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH&#8322;O (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH&#8322;O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (80 g), KCL (2 g), Na&#8322;HPO&#8324; (14.4 g), KH&#8322;PO&#8324; (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

Dans nos efforts pour déterminer les modes d’expression et la localisation sous-cellulaire des Drosophila RNAs l’échelle du génome et dans une variété de tissus, nous avons développé de nombreuses modifications et améliorations à notre origine fluorescentes in situ protocole d’hybridation (poisson). Pour faciliter le débit et la rentabilité, toutes les étapes, depuis la génération de la sonde de détection du signal, sont effectuées à l’aide de plaques de Microplaque 96 puits exon. Dioxygénine (DIG)-sondes marquées antisens RNA sont fabriqués à partir de clones d’ADNc ou ADN génomique en tant que modèles. Après fixation du tissu et la perméabilisation, sondes sont hybridées aux transcriptions d’intérêt et ensuite détectés à l’aide d’une succession d’anticorps anti-DIG conjugué à la biotine, streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) et conjugué fluorescent tyramide, qui, en présence de la HRP, produit un intermédiaire très réactif qui se lie aux régions denses d’électron des protéines juste à côté. Cette procédure d’amplification et de localisation produit un signal robuste et très localisé qui facilite les deux localisation cellulaire et subcellulaire transcription. Les protocoles fournis ont été optimisées pour produire des signaux très spécifiques dans une variété de tissus et de stades de développement. Les références sont également fournis pour des variations additionnelles qui permettent la détection simultanée de plusieurs transcriptions, ou les transcriptions et les protéines, en même temps.

La figure 6 montre des exemples des résultats obtenus à l’aide de cette procédure. Les top 3 panneaux montrent des exemples de jeunes embryons de drosophile (Figure 6, panneaux A-C), les 3 prochaines panneaux montrent des exemples de la fin des embryons de drosophile avec des signaux dans différents tissus (amnioserosa, muscles et du système nerveux central, respectivement (Figure 6, panneaux D-F). Ensuite sont des exemples de 3e instar des tissus larvaires (Figure 6, panneaux G-J). Panneaux K et L montrent des images représentant des adultes gonades (ovaires et les testicules, respectivement). Des centaines d’images ont été téléchargées et annotés dans notre consultable « fluorescent in situ drosophile database » (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
La figure 1. Contour de Fluorescent in situ hybridation (poisson) protocole clé matériel et. (A) amplification par PCR de l’ADNc. (B) In vitro la transcription pour générer DIG antisens gène-spécifique - étiqueté des sondes d’ARN dans une plaque à 96 puits (photo de la plaque figure b). (C) et (D) : adultes (femelles : ratio mâles 2:1. 300-400 mouches/bottle) mouches sont autorisés à s’accoupler pendant 3-4 jours. Embryons provenant d’une collection au jour le jour sur la nourriture de la semoule de maïs standard à 25 ° C sont transférés dans une boîte en plastique bien ventilée (1 L de nourriture de la semoule de maïs dans un récipient de taille : 8 "X 8" X 3" LWH) ou de nouvelles bouteilles en gardant une bonne densité larvaire. Pour la collection de tissus, poudre de levure active devrait être saupoudré sur le dessus de la nourriture à 24, 48 h après la ponte (AEL). (E à H) : Expériences d’hybridation fluorescente in situ effectuées sur 3 jours consécutifs. Pour les tissus qui ne pas flotter ou embryons, utilisez une plaque à 96 puits PCR comme sur la photo b avec dispositif d’aspiration 8 canaux (photo c). Pour les tissus qui flottent, comme la plupart des tissus larvaires, utilisez une plaque de fond de filtre (photo d) et évacuer le liquide de fond avec un aspirateur collecteur à l’aide de basse pression (photographie en e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figure 2. Calcul du rendement de sonde de RNA. Nouvellement synthétisé sondes antisens RNA observées sur un gel d’agarose de 1 % (5 µL/lane). Le rendement peut être catégorisé (basé sur l’intensité de la bande) comme « faible rendement » dans les couloirs 3 et 10, « rendement typique » dans les couloirs 1, 4, 5, 6 et 8 ou « high yield » dans les couloirs, 2, 7, 9, 11 et 12. Pour les échantillons avec des « rendements typiques », utiliser 10-15 µL de sonde dilué dans 100 µL de solution d’hybridation pour chaque expérience in situ . Diluer les échantillons avec « des rendements élevés » de sonde avec la solution d’hybridation supplémentaires selon l’intensité de la bande par rapport à une intensité de « sonde typique ». But est d’avoir des concentrations plus ou moins égale de la sonde dans chaque puits. La flèche pointe vers un des « sondes d’ARN », la bande supérieure sur chaque voie est la matrice d’ADN initiale. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figure 3. Principales étapes pour la collecte des embryons à grande échelle et fixation. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figure 4. Maison tube pour enlever le liquide des tissus larvaires ou flottantes. Certains tissus larvaires et adultes flottent dans la solution pendant la fixation. Cet outil simple se compose d’une maille en nylon qui s’est tenue par un 200 µL, couper la pointe, suivie d’une pointe de 1 mL comme un adaptateur pour raccordement à un aspirateur. Liquide peut être retiré en toute sécurité sans perdre n’importe quel tissu. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figure 5. Amplification du Signal de Tyramide. (1) creuser-étiqueté de sonde d’ARN antisens s’hybride avec sens endogène RNA. (2) Immuno-affinité entre anticorps primaire conjugué Biotine et DIG-UTP. (3) HRP conjugué streptavidine biotine de lie. (4) HRP catalyse la réaction de cyanine 3-tyramide et peroxyde d’hydrogène pour former des radicaux éphémère cyanine 3-tyramide. (5) radicaux de cyanine 3-tyramide lient à des résidus de tyrosine des protéines à proximité. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
La figure 6. Des images représentant in situ hybridation. Chaque panneau présente un exemple d’un ARN différent (montré en Cyan) et noyaux colorés au DAPI (indiqué en rouge). (A-C) Exemples de jeunes embryons de drosophile . (D, F) Exemples d’embryons de drosophile tardive. (G-J) Exemples de 3ème stade larvaire des tissus larvaires de drosophile (tubules malphigian, intestin, glandes salivaires et muscle respectivement). (K) ovaire adulte. (L) testicule adulte. Chaque panneau affiche le nom du gène qui la sonde est hybridant à. Barreaux de l’échelle = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Le protocole d’ARN décrit in situ hybridation permet la détection de l’ARN dans des embryons de drosophile entiers ou tissus disséqués. À l’aide de microplaques 96 puits et amplification de signal tyramide, transcriptions peuvent être détectées à un débit, sensibilité et haute résolution et à un coût relativement faible.

Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

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JoVE Journal

Genetics

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