Name: high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

Finanzielle Unterstützung für dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss HMK von Canadian Institutes of Health Research zur Verfügung gestellt (MOP 133473 gewähren).

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Das beschriebene Protokoll sieht eine reproduzierbare, hochsensiblen und wirtschaftliche Methode zur Detektion von den meisten RNAs in festen Drosophila Embryos oder Gewebe. Obwohl etwas komplizierter, als die mehr traditionell alkalische Phosphatase Methode der Sonde Erkennung verwendet, die Auflösung durch die Fische ist weit größer und die Empfindlichkeit ist vergleichbar oder verbesserte 7,8. Durch die Verwendung von ganzen oder teilweisen Mikrotiter-Platten, können die Protokolle für groß angelegte oder begrenzte Analysen von Genen von Interesse verwendet werden. Es sei darauf hingewiesen, dass die Sonden generiert möglicherweise alle erkennen oder mehrere Transkript Spleiß bildet, es sei denn, Sonden mehr speziell (z.B. einzelne Exons). Obwohl wir Sonden so klein wie 200 Nukleotide mit einigem Erfolg getestet haben, kleinere Sonden tendenziell weniger wirksam und möglicherweise weniger spezifisch. Klar, dieses Protokoll eignet sich nicht für die Erkennung von kleinen Introns, Exons, oder Micro-RNAs verarbeitet.
Obwohl dieser Ansatz einen enzymatischen Schritt verwendet, um die Stärke der Signale zu steigern, erscheint Signalintensität proportional zur Ziel-gen-Expression in einer relativ linear und breite Strecke der Ausdruck Niveaus. Bei höherer Vergrößerung, das Signal wird als Puncta oder Flecken innerhalb von Zellen und Geweben. Für relativ selten Transkripte sind nur ein paar winzige Puncta gesehen. Mit zunehmender Transkript Fülle wachsen diese in Anzahl und Größe. Wie bei einzelnen Moleküls Fisch (SmFISH), einzelne kleine Puncta kann auch einzelne RNAs entsprechen und sollte auch leicht quantifiziert werden mittels Bildgebung und Informatik Software. Vergleiche der veröffentlichten Bilder, die die SmFISH mit Bildern, die wir kuratiert haben die gleichen Ziele vorschlagen, dass die insgesamt, Empfindlichkeit und Auflösung der beiden Methoden relativ ähnlich sind, obwohl dies durch eine strengere Vergleiche getestet werden sollte. Angesichts der viel höheren Kosten des SmFISH, sollte die Methode, die hier zur Verfügung gestellten ähnliche Ergebnisse zu einem Bruchteil der Kosten geben. Jedoch, wenn das Ziel ist es, kleine Abschriften oder Teile von Transkripten zu erkennen, empfiehlt sich SmFISH.
Aufgrund der geringeren Größe des einige Fisch-Sonden kann diese Methode auch eindringende Gewebe besser sein, die groß sind oder haben erhebliche Hindernisse. Jedoch unsere Nutzung der höheren Waschmittel und Gewebe Fixierung und Permeabilisierung zwickt scheinen dieses Problem gelöst haben. Schließlich sollte obwohl für Drosophila Gewebe entwickelt, die hohe Waschmittel Puffer für seziert Gewebe hier beschrieben auch für Drosophila Embryonen sowie die meisten anderen Organismen und Gewebe arbeiten.

Neue genomweiten RNA Nachweismethoden wie RNA-Seq haben unser Wissen wann und wo Gene exprimiert werden, und was1Ebenen stark ausgebaut. Allerdings bieten diese relativ geringe zeitlichen und räumlichen Auflösung. RNA in Situ Hybridisierung ermöglicht die räumliche Verteilung der Transkripte in festen Geweben, visuell beobachtet werden, so offenbart die Details von zellulärer und subzellulärer Lokalisierung2. Mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) können noch mehr räumlichen Auflösung, da es den Einsatz von leistungsfähigen Mikroskopiertechniken, wie konfokale und leichte Blatt Mikroskopie3erlaubt. Fluoreszierende Markierungen wie DAPI können auch verwendet werden, subzelluläre Beziehungen4herstellen. Fisch erleichtert auch die Beobachtung von mehreren RNAs und Proteine gleichzeitig mit klaren Angaben Überlappung auf der subzellulären Ebene. Einzigartige Reagenzien und für doppelte Kennzeichnung erforderlichen Schritte finden Sie in den folgenden Referenzen3,5.
Die hier beschriebenen Verfahren nutzen 96-Well-Mikrotiterplatten für alle Schritte, einschließlich cDNA Vorlage Produktion (Kolonie PCR), RNA-Sonde-Produktion (mit T7, T3 oder SP6 Polymerase-abhängige Run-off-Transkription), in Situ Hybridisierung und Fluoreszenzsignal Entwicklung. Ausreichende Zahl von Embryonen oder Gewebe werden hinzugefügt, um jedes gut von 96-Well-Platte Bewertung der Konsistenz und Variabilität zu ermöglichen. Jeder erhält also eine andere Sonde. Nach Signal Entwicklung sind auf einzelne Objektträger für die mikroskopische Analyse Embryonen oder Gewebe aus jedem Brunnen angeordnet.
Die Verwendung von Tyramide Signalverstärkung (TSA) für Sonde Erkennung produziert robuste Signale mit außergewöhnlichen subzelluläre Auflösung 5,6,7,8. Die subzelluläre Lokalisation des RNAs ist ein wichtiger Regulierungsmechanismus 9 , die angezeigt wird mit nahezu allen RNAs 4,10,11auftreten. Diese Analysen haben auch gezeigt, dass viele Transkripte, die nicht durch RNA-Seq erkannt werden durch Fisch 8leicht erkannt werden. Die Anpassung der RNA in Situ Hybridisierung, 96-Well Platten ermöglicht die Analyse von bis zu 96 Gene von Interesse zu einem Zeitpunkt (mehr, wenn zusätzliche Platten verwendet werden), die Analyse von großen Datenmengen ermöglicht. Durch Schneiden der Platten in kleinere Abschnitte, wird die Methode auch einfach nur ein paar Beispiele angepasst. Das Protokoll zur Verfügung gestellt eignet sich zur Analyse der RNA-Distributionen in den meisten Arten von Geweben. Obwohl nicht gezeigt, ist es an nicht-Drosophila Gewebe sowie anpassbar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td>
			<td>Biomart (Canada)</td>
			<td>141106-1K</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>MSBVS1210</td>
			<td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate (200 &#956;l)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C18096-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH&#8322;O and 0.2&#956;m filtered (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P96-450V-C</td>
			<td>To store bacterial glycerol stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-PCR-AS-200</td>
			<td>To seal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-T205-WB-C</td>
			<td>To transfer samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>200062156</td>
			<td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &#956;g/ml or 1/400 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td>
			<td>BrandTech Scientific Inc.</td>
			<td>704526</td>
			<td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&#956;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2522</td>
			<td>Antifade reagent in mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Working concentration is 0.1 % in ddH&#8322;O. To make RNase free water 0.1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-uridine-5&#8217;-triphosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-209-256-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5804</td>
			<td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>FOR001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY002.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>DiaMed</td>
			<td>LAA42370-001</td>
			<td>Fill in heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-347</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 100 micons</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>57-103</td>
			<td>For collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 800 microns</td>
			<td>SEFAR - Nytex</td>
			<td>06-780/53</td>
			<td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>Size: 22 X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slides,frstd</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Size: 25 X 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>P/N 5017</td>
			<td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PAR070.500</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model: DNA Engine PTC-200</td>
			<td>96-well plate PCR and probe denature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picric acid solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>80456</td>
			<td>For tissue fixation I solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCL)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH&#8322;PO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PPM302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P-LID-PP</td>
			<td>Lid for storing plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>825-1-50-5S</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>87-CFILM-AL</td>
			<td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P2308- 5MG</td>
			<td>Embryo permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977015-500ml</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Remove RNase contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single stranded DNA from salmon testes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D9156</td>
			<td>For hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk (non fat power)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SKI400.500</td>
			<td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA333</td>
			<td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (HOC(COONa)(CH&#8322;COONa)&#8322; &#183; 2H&#8322;O</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td>Reagent in 20 X SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na&#8322;HPO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.1</td>
			<td>Reagent in 10 X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0131</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259-274.</td>
			<td>To fill the heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope &#38; gooseneck light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ6</td>
			<td>Tissue dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S911</td>
			<td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &#956;g/ml) for in situ.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0101</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0111</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (10 ul)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-STK-S</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (200 ul)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>27770T</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips ( 1ml)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>10200</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TRX506</td>
			<td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHA1003917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH&#8322;O (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH&#8322;O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (80 g), KCL (2 g), Na&#8322;HPO&#8324; (14.4 g), KH&#8322;PO&#8324; (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

In unseren Bemühungen, die Muster des Ausdrucks und subzelluläre Lokalisation der Drosophila RNAs auf einer genomweiten Basis zu bestimmen und in einer Vielzahl von Geweben haben wir zahlreiche Änderungen und Verbesserungen zu unserer ursprünglichen fluoreszierende in-situ entwickelt Hybridisierung (FISH)-Protokoll. Um Durchsatz und Wirtschaftlichkeit zu erleichtern, werden alle Schritte, von der Sonde Generation zur Signalerfassung, mit Exon 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Digoxygenin (DIG)-gekennzeichneten Antisense RNA-Sonden entstehen mit cDNA Klonen oder genomischer DNA als Vorlage. Nach Gewebe Fixierung und Permeabilisierung Sonden sind hybridisiert, Abschriften von Interesse und dann erkannten mit einer Reihe von Anti-DIG-Antikörper konjugiert, Biotin, Streptavidin konjugiert, Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Gewebekulturen konjugiert Tyramide, die in Anwesenheit von HRP, hochreaktive Intermediate produziert, das Elektron Dichte Regionen unmittelbar neben Proteine bindet. Verstärkung und Lokalisierung folgendermaßen erzeugen eine robust und stark lokalisierte Signal, die beide zellulärer und subzellulärer Transkript Lokalisierung erleichtert. Die Protokolle zur Verfügung gestellt wurden optimiert, um hochspezifische Signale in einer Vielzahl von Geweben und Entwicklungsstufen zu produzieren. Referenzen sind ebenfalls zusätzliche Variationen geboten, die es die simultane Detektion von mehreren Abschriften, oder Abschriften und Proteine, zur gleichen Zeit ermöglichen.

Abbildung 6 zeigt Beispiele für Ergebnisse, die mit diesem Verfahren. Die Top 3 Tafeln zeigen Beispiele der frühen Drosophila Embryos (Abbildung 6, Paneele A-C), die nächsten 3 Platten Beispiele der späten Drosophila Embryos mit Signalen in verschiedenen Geweben (Amnioserosa, Muskeln und des Zentralnervensystems, zeigen bzw. (Abbildung 6, Platten D-F). Als nächstes sind Beispiele aus 3. Instar Larven Gewebe (Abbildung 6, Paneele G-J). Platten, K und L zeigen repräsentative Bilder von Erwachsenen Gonaden (Eierstöcke und Hoden, beziehungsweise). Hunderte von Bildern wurden hochgeladen und kommentiert in unsere durchsuchbare "Fluoreszenz in Situ -Fruchtfliege-Datenbank" (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Abbildung 1. Gliederung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Protokoll und Schlüssel Ausrüstung. (A) PCR-Amplifikation der cDNA. (B) In-vitro- Transkription, Gen-spezifischen antisense DIG - generieren beschriftet RNA-Sonden in einer 96-Well-Platte (Foto von der Platte in b gezeigt). (C) und (D): Erwachsene (weiblich: männlich Verhältnis 2:1. 300-400 fliegen/Flasche) fliegen dürfen für 3-4 Tage zu Paaren. Embryonen aus einer Nacht Sammlung auf standard Maismehl Essen bei 25 ° C sind an einer gut belüfteten Kunststoff-Box übertragen (1 L Maismehl Essen in einem Container Größe: 8 "X 8" X 3" LWH) oder zu neuen Flaschen halten eine ordnungsgemäße Larven Dichte. Für Gewebe Sammlung sollte aktive Hefe Pulver auf das Essen in 24, 48 h nach der Eiablage (AEL) gestreut werden. (E bis H): Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Experimente durchgeführt über 3 aufeinander folgenden Tagen. Verwenden Sie für Embryonen oder Geweben, die nicht schwimmen eine 96-Well-PCR-Platte wie in Foto b mit 8-Kanal-Sauger (Foto c) gezeigt. Verwenden Sie für Gewebe, die schweben, wie die meisten Larven Gewebe einen Filter-Talsohle Teller (Foto d) und entfernen Sie Flüssigkeit von unten mit einem vielfältigen Absauganlage mit niedrigem Druck (Foto e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Bestimmung der RNA-Sonde Ausbeute. Neu synthetisiert Antisense RNA-Sonden auf einem 1 % Agarose-Gel (5 µL/Bahn) beobachtet. Die Rendite kann (basierend auf der Intensität der Band) kategorisiert werden als "niedrige Rendite" in Bahnen 3 und 10, "typische Rendite" in Gassen 1, 4, 5, 6 und 8 oder "high-Yield" in Bahnen 2, 7, 9, 11 und 12. Verwenden Sie für Proben mit einem "typischen Renditen" 10-15 µL der Sonde in 100 µL für jedes Experiment in Situ Hybridisierung Lösung verdünnt. Proben mit hohen Erträgen der Sonde mit zusätzlichen Hybridisierung Lösung entsprechend der Band Intensität im Vergleich zu einer "typischen Probe" Intensität zu verdünnen. Sollen Sie etwa gleich letzte Sonde Konzentrationen in jede Vertiefung. Der Pfeil zeigt auf eine der "RNA-Sonden", ist das höhere Band auf jeder Bahn die ursprüngliche DNA-Vorlage. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Wichtige Schritte für eine groß angelegte Embryo Sammlung und Fixierung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Hausgemachte Rohr zum Entfernen von Flüssigkeit aus den Larven oder schwimmenden Geweben. Einige Larven und adulten Geweben schweben in Lösung während der Fixierung. Dieses einfache Werkzeug besteht aus einem Nylon-Gewebe im Besitz einer 200 µL Schneiden Spitze, gefolgt von einer 1 mL-Tipp als einen Adapter zum Verbinden mit einer Absauganlage. Flüssigkeit kann sicher entfernt werden, ohne dass jedes Gewebe. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Abbildung 5. Tyramide Signalverstärkung. (1) DIG-markierten antisense RNA-Sonde hybridisiert mit endogenen Sinn RNA. (2) Immuno-Affinität Bindung zwischen Biotin konjugiert Primärantikörper und DIG-UTP. (3) HRP konjugiert Streptavidin bindet Biotin. (4) HRP katalysiert die Cyanin 3-Tyramide und Wasserstoffperoxid Reaktion um kurzlebige Cyanin-3-Tyramide-radikale bilden. (5) Cyanin-3-Tyramide-radikalen binden an Tyrosin Rückstände auf nahe gelegenen Proteine. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Abbildung 6. Vertreter in Situ Hybridisierung Bilder. Jedes Panel zeigt ein Beispiel für eine unterschiedliche RNA (siehe Cyan) und Kerne gebeizt mit DAPI (rot dargestellt). (A-C) Beispiele der frühen Drosophila Embryos. (D, F) Beispiele der späten Drosophila Embryos. (G-J) Beispiele für 3. instar Drosophila Larven Gewebe (Malphigian Tubuli, Mitteldarm, Speicheldrüse und Muskel beziehungsweise). (K) Erwachsenen Eierstock. (L) Erwachsenen Hoden. Jedes Panel zeigt den Namen der das Gen, dem die Sonde zu züchten ist. Skalieren von Balken = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

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Research

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