Name: high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על ידי מענק כדי HMK על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק 133473 סמרטוט).

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

לעורכים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול המתואר מספק שיטה לשחזור מאוד, רגישה, וחסכוני עבור הגילוי של RNAs רוב קבוע עוברי דרוזופילה או רקמות. למרות מעט יותר מסובך ממה יותר השתמשו באופן מסורתי phosphatase אלקליין בשיטה של בדיקה לזיהוי, הרזולוציה מתקבל על ידי דג גדול בהרבה, והוא הרגישות דומות או משופרת 7,8. באמצעות לוחות שלמים או חלקיים microtiter, הפרוטוקולים יכול לשמש עבור ניתוחים בקנה מידה גדול או מוגבלת של הגנים של עניין. יצוין כי הגששים שנוצר עשוי לזהות את כל או אחוי התעתיק מספר טפסים אלא אם הגששים נועדו יותר במיוחד (קרי, exons יחיד). למרות בדקנו הגששים קטן כמו נוקלאוטידים 200 עם הצלחה סבירים, הגששים קטנים נוטים להיות פחות יעיל, וייתכן שהוא פחות ספציפי. . בבירור, פרוטוקול זה אינו מתאים עבור זיהוי אינטרונים קטן, exons, או מעובד מיקרו Rna.
למרות גישה זו משתמשת צעד אנזימטי כדי להגביר את עוצמת האותות, עוצמת אות מופיעה כדי להיות פרופורציונלי היעד גנים במגוון יחסית לינארית ורחב של רמות הביטוי. בהגדלה גבוהה יותר, האות נתפסת puncta או ספאקלס בתוך תאים ורקמות. עבור תעתיקים נדירים יחסית נראים רק כמה puncta זעירים. התעתיק שפע גודלת, אלה גדלים מספר וגודל. כמו עם מולקולה בודדת דגים (smFISH), puncta קטן יחיד יתאימו גם ל- RNAs יחיד, צריך גם להיות ברצון לכמת באמצעות תוכנת הדמיה ואינפורמטיקה. השוואות של תמונות שפורסמו שהושג באמצעות smFISH עם תמונות כי לנו יש מספר פעמים עבור המטרות אותן מציע כי בסך הכל, רגישות ורזולוציה של שתי השיטות דומים יחסית, למרות זה צריך להיבדק על ידי השוואות קפדנית יותר. בהתחשב את חשבון גבוה יותר של smFISH, פעולת השירות שסופק כאן צריך לתת תוצאות דומות בכל חלק של העלות. עם זאת, אם המטרה היא לזהות תעתיקים קטן, או חלקים ברורים של הפרוטוקולים, מומלץ smFISH.
בשל גודל קטן יותר של הגששים דגים מסוימים, שיטה זו עשויה גם להיות יותר החודר לרקמות גדולים, או מכשולים משמעותיים. עם זאת, השימוש רמות גבוהות דטרגנט וצובטת רקמות קיבוע ו permeabilization מופיעים פתר בעיה זו. בסופו של דבר, למרות שפותח דרוזופילה לרקמות, המאגרים דטרגנט גבוהה המתוארים כאן בשביל לרקמות ביתור צריך גם לעבוד עבור עוברי דרוזופילה וכן רוב אחרים אורגניזמים ורקמות.

שיטות זיהוי RNA של הגנום כולו חדשות כגון ה-RNA-seq הרחיבו מאוד את הידע שלנו של מתי ואיפה באים לידי ביטוי של גנים, ועל איזה רמות1. עם זאת, אלה מספקים טמפורלית הדלה יחסית ופתרון מרחבית. רנ א בהכלאה באתרו מאפשר את התפוצה המרחבית של תעתיקים חזותית שחלים ברקמות קבוע, ובכך לחשוף את הפרטים של לוקליזציה הסלולר, subcellular2. שימוש פלורסנט היברידיזציה (דגים) מאפשר רזולוציה מרחבית יותר שכן היא מאפשרת את השימוש בטכניקות מיקרוסקופ רב עוצמה, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי וגיליון אור3. סמני פלורסנט כגון דאפי יכול לשמש גם כדי ליצור קשרים subcellular4. דגים מקלה גם על התצפית של RNAs וחלבונים מרובים בו זמנית עם סימנים ברורים של חפיפה ברמת subcellular. ניתן למצוא ב-3,הפניות הבאות5ריאגנטים ייחודי השלבים הנדרשים עבור תיוג-כפול.
ההליכים המתוארים כאן לנצל microtiter 96-ובכן לוחות עבור כל השלבים, כולל ייצור תבנית cDNA (המושבה PCR), ייצור בדיקה RNA (באמצעות שעתוק תלויי-פולימראז הגשמים T7, T3 או SP6) באתרו בתוך הכלאה, ו פיתוח אות ניאון. מספר מספיק של העוברים או רקמות נוספות כל טוב של צלחת 96-ובכן כדי לאפשר הערכה של עקביות ולשינויים. כל אחד מקבל אז בדיקה שונים. לאחר פיתוח אות, העוברים או רקמות מכל קידוח נערכים בשקופיות בודדות מיקרוסקופ לבדיקה מיקרוסקופית.
השימוש tyramide אות הגברה (TSA) לצורך זיהוי המכשיר מייצר אותות חזקים עם רזולוציה יוצאת דופן subcellular 5,6,7,8. לוקליזציה subcellular של RNAs הוא מנגנון רגולטורי חשוב 9 שמופיע אצל כמעט כל RNAs 4,10,11. ניתוחים אלה הראו גם כי העותק רבים לא מזוהים על ידי RNA-seq מאותרים בקלות על ידי דגים 8. העיבוד של RNA בחיי עיר הכלאה ללוחות 96-ובכן מאפשר ניתוח של הגנים עד 96 של עניין בכל פעם (צלחות יותר אם נוספים משמשים), ביצוע ניתוח של אלגוריתמית אפשרי. על ידי חיתוך הלוחות למקטעים קטנים יותר, השיטה מותאם בקלות גם רק כמה דוגמאות. פרוטוקול סיפק מתאימה לניתוח של RNA התפלגויות של רוב סוגי רקמות. אמנם לא מוצג, זה וישימה הלא -דרוזופילה רקמות גם כן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td>
			<td>Biomart (Canada)</td>
			<td>141106-1K</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>MSBVS1210</td>
			<td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate (200 &#956;l)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C18096-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH&#8322;O and 0.2&#956;m filtered (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P96-450V-C</td>
			<td>To store bacterial glycerol stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-PCR-AS-200</td>
			<td>To seal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-T205-WB-C</td>
			<td>To transfer samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>200062156</td>
			<td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &#956;g/ml or 1/400 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td>
			<td>BrandTech Scientific Inc.</td>
			<td>704526</td>
			<td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&#956;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2522</td>
			<td>Antifade reagent in mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Working concentration is 0.1 % in ddH&#8322;O. To make RNase free water 0.1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-uridine-5&#8217;-triphosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-209-256-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5804</td>
			<td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>FOR001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY002.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>DiaMed</td>
			<td>LAA42370-001</td>
			<td>Fill in heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-347</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 100 micons</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>57-103</td>
			<td>For collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 800 microns</td>
			<td>SEFAR - Nytex</td>
			<td>06-780/53</td>
			<td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>Size: 22 X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slides,frstd</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Size: 25 X 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>P/N 5017</td>
			<td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PAR070.500</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model: DNA Engine PTC-200</td>
			<td>96-well plate PCR and probe denature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picric acid solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>80456</td>
			<td>For tissue fixation I solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCL)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH&#8322;PO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PPM302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P-LID-PP</td>
			<td>Lid for storing plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>825-1-50-5S</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>87-CFILM-AL</td>
			<td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P2308- 5MG</td>
			<td>Embryo permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977015-500ml</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Remove RNase contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single stranded DNA from salmon testes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D9156</td>
			<td>For hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk (non fat power)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SKI400.500</td>
			<td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA333</td>
			<td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (HOC(COONa)(CH&#8322;COONa)&#8322; &#183; 2H&#8322;O</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td>Reagent in 20 X SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na&#8322;HPO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.1</td>
			<td>Reagent in 10 X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0131</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259-274.</td>
			<td>To fill the heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope &#38; gooseneck light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ6</td>
			<td>Tissue dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S911</td>
			<td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &#956;g/ml) for in situ.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0101</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0111</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (10 ul)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-STK-S</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (200 ul)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>27770T</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips ( 1ml)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>10200</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TRX506</td>
			<td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHA1003917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH&#8322;O (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH&#8322;O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (80 g), KCL (2 g), Na&#8322;HPO&#8324; (14.4 g), KH&#8322;PO&#8324; (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

המאמצים שלנו כדי לקבוע דפוסי ביטוי ולוקליזציה subcellular של דרוזופילה RNAs על בסיס הגנום כולו, ו במגוון של רקמות, פיתחנו שינויים ושיפורים רבים כדי שלנו המקורי פלורסנט סיטו פרוטוקול הכלאה (דגים). כדי להקל על התפוקה ויחס עלות-תועלת, כל השלבים, מדור בדיקה לאיתור אות, מבוצעות באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter אקסון. Digoxygenin (מחדירים)-הגששים שכותרתה antisense RNA מיוצרים באמצעות שיבוטים cDNA או דנ א גנומי כתבניות. לאחר קיבוע הרקמה, permeabilization, הגששים הם hybridized כדי תעתיקים של הריבית, אז שזוהו באמצעות רצף של נוגדן אנטי החפירה מצומדת כדי ביוטין, streptavidin מצומדת כדי חזרת peroxidase (HRP) ו fluorescently מצומדת . tyramide, המייצרת בנוכחות HRP, בינוני מאוד תגובתי המאגד לאזורים צפופים אלקטרונים של חלבונים סמוכים מיידית. השלבים הגברה ולוקליזציה לייצר אות מקומי מאוד ועמיד המקל על שני לוקליזציה התעתיק סלולרית ו- subcellular. הפרוטוקולים סיפק מוטבו להפקת אותות ספציפי מאוד במגוון רחב של רקמות, שלבים התפתחותיים. הפניות ניתנים גם וריאציות נוספות המאפשרות זיהוי בו זמנית מספר תעתיקים, או תעתיקים, חלבונים, באותו זמן.

איור 6 מציג דוגמאות של התוצאות המתקבלות באמצעות הליך זה. הלוחות 3 העליון להראות דוגמאות של עוברי דרוזופילה מוקדם (איור 6, לוחות A-C), 3 הבא מראות דוגמאות של המנוח עוברי דרוזופילה עם אותות ברקמות שונות (amnioserosa, השרירים, מערכת העצבים המרכזית, בהתאמה (איור 6, לוחות D-F). הבא דוגמאות מ-3 לחלל זחל רקמות (איור 6, לוחות G-J). K ו- L מראות להחליפן בתמונות של בלוטות המין למבוגרים (השחלה ואת testis, בהתאמה). יש מאות תמונות שהועלו, מבואר ב שלנו ניתן לחיפוש 'פלורסנט בחיי עיר זבוב הפירות מסד' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
איור 1. קווי המתאר של פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דגים) פרוטוקול ומפתח מכשור. (א) PCR הגברה של cDNA. (B) במבחנה שעתוק כדי ליצור גנים ספציפיים antisense החפירה - תוויות RNA הגששים בצלחת 96-ובכן (צילום של צלחת שמוצג b). (ג) ו- (D): מבוגרים (נקבה: יחס זכר 2:1. 300-400 זבובים/בקבוק) זבובים מותר להזדווג במשך 3-4 ימים. העוברים של אוסף לילה על תקן קמח תירס מזון 25 ° c מועברים קופסת פלסטיק מאוורר היטב (1 ליטר של קמח תירס מזון במיכל בגודל: 8 "X 8" 3" LWH) או בקבוקים חדשים, שמירה על צפיפות זחל נאותה. אוסף רקמה, אבקת שמרים פעילים צריך להיות התיז על האוכל-24, 48 שעות לאחר הנחת (AEL) ביצה. (E עד H): פלורסנט בחיי עיר הכלאה ניסויים שבוצעו על פני 3 ימים רצופים. עבור עוברי או רקמות שצפים לא, השתמש צלחת PCR 96-ובכן כפי שמוצג ב' תצלום עם העצמות ערוץ 8 (תצלום c). בשביל לרקמות שצפים, כמו רוב רקמות זחל, להשתמש צלחת עם תחתית מסנן (צילום ברה) והסר נוזל מלמטה עם העצמות סעפת באמצעות לחץ נמוך (צילום ב- e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
באיור 2. קביעת התשואה בדיקה RNA. לאחרונה מסונתז הגששים antisense RNA מובחנים ג'ל agarose 1% (5 µL lane). התשואה יכולים להיות מסווגים (מבוסס על האינטנסיביות של הלהקה) 'תשואה נמוכה' הנמצאים בסמטאות 3 ו-10, 'תשואה טיפוסי' הנמצאים בסמטאות 1, 4, 5, 6 ו 8 או 'תשואה גבוהה' הנמצאים בסמטאות 2, 7, 9, 11 ו- 12. לשימוש דגימות עם 'טיפוסי תשואות', 10-15 µL של בדיקה מעורבבת עם µL 100 של הכלאה פתרון עבור ניסוי ב באתרו . לדלל דגימות עם 'תפוקה גבוהה' של המכשיר עם פתרון הכלאה נוספים עם הלהקה כמות יחסית עוצמת 'אופייני בדיקה'. שואפים יש ריכוזים שווים בדיקה סופית מכל קידוח. החץ מצביע על אחד "הגששים RNA,' הלהקה גבוה יותר על כל ליין היא תבנית ה-DNA המקורית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
איור 3. רס ן צעדים אוסף העובר בקנה מידה גדול, קיבעון. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
באיור 4. צינור תוצרת בית הסרת נוזל לרקמות זחל או צף. ממחטה זחל ומבוגרים מרחף בתמיסה במהלך קיבעון. כלי פשוט זה מורכב רשת ניילון מוחזק על ידי µL 200 לחתוך עצה, ואחריו טיפ 1 מ"ל בתור מתאם להתחבר העצמות. נוזל ניתן להסיר בבטחה מבלי לאבד את כל רקמות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
איור 5. הגברה של האות Tyramide. (1) לחפור התווית על-ידי בדיקה antisense RNA hybridizes בחוש אנדוגני RNA. (2) כריכת חיסונית-זיקה בין נוגדן ראשוני מצומדת ביוטין החפירה-UTP. (3) HRP מצומדת ביוטין איגודים streptavidin. (4) HRP מזרז את cyanine 3-tyramide, מימן על-חמצני התגובה כדי ליצור רדיקלים 3-tyramide cyanine קצרת ימים. (5) cyanine 3-tyramide רדיקלים לאגד טירוזין שאריות על חלבונים הסמוכים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
איור 6. נציג בחיי עיר הכלאה תמונות. כל לוח מראה דוגמה של RNA שונים (מוצג בציאן) ואת הגרעינים צבעונית עם דאפי (מוצג בצבע אדום). (א-ג) דוגמאות עוברי דרוזופילה מוקדם. (D, F) דוגמאות מאוחר עוברי דרוזופילה . (G-J) דוגמאות של 3 instar רקמות זחל דרוזופילה (malphigian בקוריאנית, פיתול, בלוטות ושרירים בהתאמה). (K) השחלה למבוגרים. (יב) למבוגרים testis. כל לוח מציג את השם של הגן זה המכשיר הוא hybridizing ל. גודל ברים = 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

כרומוגניים היברידיזציה באתרו הכלי עבור אבחון הקשורות HPV וסרטן צוואר

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

עיצוב אוטומטי, תפוקה גבוהה, ניסויים בגידול תאים רציפים באמצעות הפיתוח

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...