Name: high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

Finanziamento per questo progetto ha fornito una sovvenzione alla HMK dal canadese istituti di salute ricerca (concedere 133473 MOP).

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Il protocollo descritto fornisce un metodo altamente riproducibile, sensibile ed economico per la rilevazione della maggior parte RNAs in fissa embrioni della drosofila o tessuti. Anche se leggermente più complessa rispetto più tradizionalmente utilizzato metodo di fosfatasi alcalina di sonda rilevazione, la risoluzione ottenuta da pesce è molto più grande e la sensibilità è paragonabile o migliore 7,8. Utilizzando piastre microtiter intero o parziale, dei protocolli possono essere utilizzati per analisi su larga scala o limitati di geni di interesse. Dovrebbe essere notato che le sonde generate potrebbero rilevare tutti o multiple della giuntura di trascrizione forma a meno che le sonde sono più specificamente progettati (cioè, singoli esoni). Anche se abbiamo testato sonde piccole come 200 nucleotidi con discreto successo, sonde più piccole tendono ad essere meno efficaci e possono essere meno specifici. Chiaramente, questo protocollo non è appropriato per la rilevazione di piccoli introni, esoni, o elaborati microRNA.
Sebbene questo approccio utilizza un passaggio enzimatico per aumentare la forza del segnale, intensità del segnale sembra essere proporzionale all'espressione genica in una relativamente lineare e ampia gamma di livelli di espressione. A maggiore ingrandimento, il segnale è visto come puncta o macchioline all'interno di cellule e tessuti. Per le trascrizioni relativamente rare sono visti solo pochi piccoli puncta. Abbondanza di trascrizione aumenta, questi si sviluppano in numero e dimensioni. Come con la singola molecola pesce (smFISH), singola puncta piccolo può anche corrispondere a singolo RNAs e inoltre dovrebbe essere facilmente quantificato utilizzando il software di imaging e informatica. Confronti di immagini pubblicate ottenute mediante smFISH con le immagini che abbiamo abbiamo curato per i medesimi obiettivi suggeriscono che il complessivo, la sensibilità e la risoluzione dei due metodi sono relativamente simili, anche se questo dovrebbe essere testato tramite i confronti più rigorosi. Dato il costo molto più elevato di smFISH, il metodo fornito qui dovrebbe dare risultati simili a una frazione del costo. Tuttavia, se l'obiettivo è quello di rilevare piccole trascrizioni o parti distinte di trascrizioni, smFISH è raccomandato.
A causa delle dimensioni più piccole di alcune sonde FISH, questo metodo può anche essere meglio a tessuti penetranti che sono grandi o con barriere significative. Tuttavia, il nostro uso di livelli più elevati di detersivo e tweaks di fissazione e permeabilizzazione tessuto sembrano hanno risolto questo problema. Infine, sebbene sviluppato per tessuti di Drosophila , il buffer di detergente alta descritto qui per tessuti dissecati dovrebbe funzionare anche per tessuti, nonché la maggior parte altri organismi ed embrioni della drosofila .

Nuovi metodi di rilevamento RNA genoma come RNA-seq hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza di dove e quando i geni sono espressi, e a quali livelli di1. Tuttavia, questi forniscono relativamente scarsa risoluzione spaziale e temporale. Ibridazione in situ RNA permette la distribuzione spaziale delle trascrizioni da osservare visivamente in tessuti fissi, rivelando così i dettagli di localizzazione cellulare e subcellulare2. Usando l'ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette maggiore risoluzione spaziale come consente l'utilizzo di tecniche di microscopia potente, come di microscopia confocale e leggero foglio3. Marcatori fluorescenti come DAPI è utilizzabile anche per stabilire relazioni sottocellulare4. PESCE, inoltre, facilita l'osservazione di più di RNA e proteine contemporaneamente con chiare indicazioni di sovrapposizione a livello subcellulare. Reagenti unici e passaggi necessari per doppia marcatura possono essere trovati nei seguenti riferimenti3,5.
Le procedure descritte qui utilizzano 96 piatti di microtitolo per tutti i passaggi, tra cui produzione di modello di cDNA (PCR della Colonia), produzione di sonda RNA (mediante trascrizione della polimerasi dipendente dal dilavamento T7, T3 o SP6), ibridazione in situ , e sviluppo del segnale fluorescente. Un numero sufficiente di embrioni o tessuti vengono aggiunti a ogni bene della piastra 96 pozzetti per consentire la valutazione della coerenza e della variabilità. Bene, allora ognuno riceve una sonda diversa. Dopo lo sviluppo di segnale, embrioni o tessuti da ogni pozzetto sono schierati su vetrini da microscopio individuali per l'analisi al microscopio.
L'uso di amplificazione del segnale di microarray (TSA) per sonda rilevazione produce segnali robusti con una risoluzione eccezionale subcellulare 5,6,7,8. La localizzazione subcellulare di RNA è un importante meccanismo di regolazione 9 che sembra accadere con praticamente tutti gli RNA 4,10,11. Queste analisi hanno inoltre dimostrato che molte trascrizioni che non vengono rilevate da RNA-seq vengono prontamente rilevate da pesce 8. L'adattamento di RNA in situ ibridazione per piastre da 96 pozzetti permette l'analisi di fino a 96 geni di interesse in un momento (più se ulteriori piastre vengono utilizzati), rendere possibile l'analisi di DataSet di grandi dimensioni. Tagliando le piastre in sezioni più piccole, il metodo è anche facilmente adattato a pochi campioni. Il protocollo fornito è appropriato per l'analisi delle distribuzioni di RNA nella maggior parte dei tipi di tessuti. Anche se non indicato, è adattabile ai non - tessutidella drosofila pure.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td>
			<td>Biomart (Canada)</td>
			<td>141106-1K</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>MSBVS1210</td>
			<td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate (200 &#956;l)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C18096-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH&#8322;O and 0.2&#956;m filtered (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P96-450V-C</td>
			<td>To store bacterial glycerol stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-PCR-AS-200</td>
			<td>To seal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-T205-WB-C</td>
			<td>To transfer samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>200062156</td>
			<td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &#956;g/ml or 1/400 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td>
			<td>BrandTech Scientific Inc.</td>
			<td>704526</td>
			<td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&#956;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2522</td>
			<td>Antifade reagent in mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Working concentration is 0.1 % in ddH&#8322;O. To make RNase free water 0.1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-uridine-5&#8217;-triphosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-209-256-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5804</td>
			<td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>FOR001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY002.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>DiaMed</td>
			<td>LAA42370-001</td>
			<td>Fill in heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-347</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 100 micons</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>57-103</td>
			<td>For collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 800 microns</td>
			<td>SEFAR - Nytex</td>
			<td>06-780/53</td>
			<td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>Size: 22 X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slides,frstd</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Size: 25 X 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>P/N 5017</td>
			<td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PAR070.500</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model: DNA Engine PTC-200</td>
			<td>96-well plate PCR and probe denature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picric acid solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>80456</td>
			<td>For tissue fixation I solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCL)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH&#8322;PO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PPM302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P-LID-PP</td>
			<td>Lid for storing plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>825-1-50-5S</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>87-CFILM-AL</td>
			<td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P2308- 5MG</td>
			<td>Embryo permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977015-500ml</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Remove RNase contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single stranded DNA from salmon testes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D9156</td>
			<td>For hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk (non fat power)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SKI400.500</td>
			<td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA333</td>
			<td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (HOC(COONa)(CH&#8322;COONa)&#8322; &#183; 2H&#8322;O</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td>Reagent in 20 X SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na&#8322;HPO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.1</td>
			<td>Reagent in 10 X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0131</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259-274.</td>
			<td>To fill the heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope &#38; gooseneck light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ6</td>
			<td>Tissue dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S911</td>
			<td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &#956;g/ml) for in situ.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0101</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0111</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (10 ul)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-STK-S</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (200 ul)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>27770T</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips ( 1ml)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>10200</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TRX506</td>
			<td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHA1003917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH&#8322;O (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH&#8322;O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (80 g), KCL (2 g), Na&#8322;HPO&#8324; (14.4 g), KH&#8322;PO&#8324; (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

Nei nostri sforzi per determinare i modelli di espressione e localizzazione subcellulare di Drosophila RNAs su una base del genoma e in una varietà di tessuti, abbiamo sviluppato numerose modifiche e miglioramenti al nostro originale fluorescente in situ protocollo di ibridazione (pesce). Per facilitare la velocità effettiva e convenienza, tutte le fasi, dalla generazione di sonda per il rilevamento del segnale, vengono eseguite utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti esone. Digoxygenin (DIG)-etichettati antisenso RNA sonde sono prodotte utilizzando DNA genomico o cDNA cloni come modelli. Dopo il fissaggio del tessuto e permeabilizzazione, sonde sono ibridate al trascrizioni di interesse e quindi rilevato utilizzando una successione di anticorpo anti-DIG coniugato con biotina, streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP) e coniugato fluorescente tyramide, che in presenza di HRP, produce un intermedio altamente reattivo che si lega alle regioni densi dell'elettrone di proteine immediatamente adiacente. Questi passaggi di amplificazione e localizzazione producono un segnale robusto e altamente localizzato che facilita la localizzazione sia trascrizione cellulare e subcellulare. I protocolli forniti sono stati ottimizzati per produrre segnali altamente specifici in una varietà di tessuti e stadi di sviluppo. Inoltre vengono forniti riferimenti per variazioni aggiuntive che consentono la rilevazione simultanea di più trascrizioni, o trascrizioni e proteine, allo stesso tempo.

Figura 6 Mostra esempi di risultati ottenuti con questa procedura. Il top 3 pannelli mostrano esempi di primi embrioni della drosofila (Figura 6, pannelli A-C), il successivo 3 pannelli mostrano esempi di ritardo embrioni della drosofila con segnali in tessuti differenti (amnioserosa, muscoli e sistema nervoso centrale, rispettivamente (Figura 6, pannelli D-F). Poi ci sono esempi da 3rd instar larvali tessuti (Figura 6, pannelli G-J). Pannelli K e L Visualizza immagini rappresentative da adulti gonadi (ovaie e testicoli, rispettivamente). Centinaia di immagini è state caricate e annotata nel nostro ricercabili 'fluorescente in situ moscerino della frutta database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Figura 1. Contorno di fluorescenza in situ di ibridazione (pesce) protocollo chiave attrezzature e. (A) l'amplificazione di PCR del cDNA. (B) trascrizione In vitro per generare gene-specifico antisenso DIG - sonde di RNA in una piastra a 96 pozzetti (foto della piastra mostrata in b). (C) e (D): adulti (femminile: rapporto maschio 2:1. 300-400 mosche/bottiglia) mosche sono permesso di accoppiarsi per 3-4 giorni. Embrioni da una raccolta durante la notte il cibo di farina di mais standard a 25 ° C a una scatola di plastica ben ventilata (1 L di cibo di farina in un contenitore di dimensioni: 8 "X 8" X 3" LWH) o a nuove bottiglie mantenendo una corretta densità larvale. Per la raccolta di tessuto, polvere di lievito attivo dovrebbe essere spruzzata sulla sommità del cibo a 24, 48 ore dopo (AEL) la deposizione delle uova. (E-H): Gli esperimenti di ibridazione fluorescente in situ effettuate oltre 3 giorni consecutivi. Per gli embrioni o tessuti che non galleggiano, utilizzare una piastra PCR a 96 pozzetti, come mostrato in fotografia b con aspiratore 8 canali (foto c). Per i tessuti che galleggiano, come la maggior parte dei tessuti larvale, utilizzare un filtro con il fondo piatto (fotografia in d) e rimuovere il liquido dal basso con un aspiratore collettore utilizzando bassa pressione (foto e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figura 2. Determinazione del rendimento sonda RNA. Recentemente sintetizzato sonde antisenso RNA osservate su un gel di agarosio 1% (5 µ l/lane). Il rendimento può essere categorizzato (basato sull'intensità della band) come 'bassa resa' in vicoli 3 e 10, 'rendimento tipico' nelle corsie 1, 4, 5, 6 e 8 o 'ad alto rendimento' nelle corsie 2, 7, 9, 11 e 12. Per campioni con 'rendimenti tipici', utilizzare 10-15 µ l di sonda diluito in 100 µ l di soluzione di ibridazione per ogni esperimento in situ . Diluire i campioni con alti rendimenti della sonda con la soluzione di ibridazione aggiuntiva secondo l'intensità di banda rispetto a un'intensità 'tipico sonda'. Mirare ad avere concentrazioni di sonda finale approssimativamente uguale in ciascun pozzetto. La freccia punta verso una delle sonde' RNA', la banda superiore su ogni corsia è il modello di DNA originale. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figura 3. Principali passaggi per una raccolta di embrioni su larga scala e fissazione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figura 4. In casa tube per rimuovere il liquido dai tessuti larvali o galleggianti. Alcuni tessuti larvali e adulti galleggiano in soluzione durante la fissazione. Questo semplice strumento è costituito da una rete di nylon, tenuta da un 200 µ l taglio punta, seguita da una mancia di 1 mL come un adattatore per collegare a un aspiratore. Liquido può essere tranquillamente rimosso senza perdere qualsiasi tessuto. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figura 5. Amplificazione del segnale di tyramide. (1) scavare-contrassegnata sonda RNA antisenso ibridizza con senso endogeno RNA. (2) Immuno-affinità che lega tra anticorpo primario coniugato con biotina e DIG-UTP. (3) HRP coniugato streptavidina biotina si lega. (4) HRP catalizza la reazione di cianina 3-microarray e perossido di idrogeno per formare i radicali di breve durata cianina 3-microarray. (5) i radicali cianina 3-microarray associare ai residui della tirosina di proteine nelle vicinanze. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Nella figura 6. Rappresentante in situ immagini ibridazione. Ogni pannello viene illustrato un esempio di un RNA diverso (mostrato in ciano) e nuclei macchiati con DAPI (mostrato in rosso). (A-C) Esempi di primi embrioni della drosofila . (D, F) Esempi di tardi embrioni della drosofila . (G-J) Esempi di 3rd instar larvale tessuti della drosofila (tubuli malphigian, muscolo, della ghiandola salivaria e del midgut rispettivamente). (K) adulto dell'ovaia. (L) testicolo adulto. Ogni pannello viene visualizzato il nome del gene che la sonda è ibridazione a. Barre di scala = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Ricerca

Genetica

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Chromogenic In Situ Hybridization è uno strumento per la diagnosi del cancro della testa e del collo correlate all'HPV

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...