Name: high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

Midler støtte til dette prosjektet ble gitt av en bevilgning til HMK av den kanadiske institutter for helseforskning (gi MOPP 133473).

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Beskrevet protokollen inneholder en svært reproduserbare, følsom og økonomisk metode for påvisning av de fleste RNAs i fast Drosophila embryo eller vev. Selv om litt mer komplisert enn mer tradisjonelt brukt alkalisk fosfatase metoden av sonden, oppløsningen ved fisk er langt større og følsomheten er tilsvarende eller bedre 7,8. Ved å bruke hele og delvise microtiter plater, kan protokollene brukes for store eller begrenset analyser av gener av interesse. Det bør bemerkes at sonder generert oppdager alle eller flere transkripsjon skjøte danner med mindre sonder er mer spesielt utformet (dvs. enkel exons). Selv om vi har testet sonder så lite som 200 nukleotider med rimelig vellykket, mindre sonder pleier å være mindre effektiv og kan være mindre spesifikk. Tydelig, denne protokollen er ikke riktig for påvisning av små introns, exons, eller behandlet microRNAs.
Selv om denne tilnærmingen bruker en enzymatisk skritt for å øke styrken på signalene, synes signalet intensitet å være proporsjonal med målet genuttrykk i et relativt lineære og bredt spekter av uttrykk. Ved høyere forstørrelse, signalet er sett på som puncta eller flekker i celler og vev. Relativt sjeldne transkripsjoner er bare noen små puncta sett. Som transkripsjon overflod vokser dette i antall og størrelse. Som med ett molekyl fisk (smFISH), enkelt små puncta kan også tilsvarer én RNAs og bør også lett kvantifiseres bruker bildebehandling og informatikk. Sammenligninger av publiserte bilder hentet ved hjelp av smFISH med bilder som vi har kuratert for samme mål foreslår at samlet, følsomhet og oppløsning av de to metodene er relativt lik, men dette bør testes av strengere sammenligninger. Gitt mye høyere bekostning av smFISH, bør metoden her gi lignende resultater på en brøkdel av prisen. Hvis målet er å oppdage små utskrifter eller atskilte deler av transkripsjoner, anbefales imidlertid smFISH.
På grunn av mindre størrelsen av noen fisk sonder, kan denne metoden også være bedre på gjennomtrengende vev som er store eller har utfordringer. Men vår bruk av vaskemiddel nivået og vev fiksering og permeabilization tweaks synes å ha løst problemet. Til slutt, selv om utviklet for Drosophila vev, høy vaskemiddel bufferne beskrevet her for dissekert vev burde likeledes arbeide for Drosophila embryo som de fleste andre organismer og vev.

Nye genomet hele RNA gjenkjenningsmetoder som RNA-seq utvidet sterkt vår kunnskap når og hvor gener som er uttrykt, og på hvilke nivåer1. Dette gir imidlertid relativt dårlig timelige og romlig oppløsning. RNA i situ hybridisering lar den romlige fordelingen av transkripsjoner å visuelt i fast vev, dermed avslører detaljer om mobilnettet og subcellular lokalisering2. Med fluorescerende i situ hybridisering (fisk) kan enda mer romlig oppløsning som det tillater bruk av kraftige mikroskopi teknikker, som AC confocal og lys ark mikroskopi3. Fluorescerende markører som DAPI kan også brukes til å etablere subcellular relasjoner4. FISK Letter også observasjon av flere RNAs og proteiner samtidig med tydelige indikasjoner på overlapping på subcellular nivå. Unik reagenser og trinnene som er nødvendig for dobbel-merking kan finnes i følgende referanser3,5.
Prosedyrene som er beskrevet her utnytte 96-brønnen microtiter plater for alle trinnene, inkludert cDNA mal produksjon (kolonien PCR), RNA sonde produksjon (med T7, T3 eller SP6 polymerase-avhengige avrenning transkripsjon), i situ hybridisering, og fluorescerende signal utvikling. Tilstrekkelig antall embryo eller vev legges til hver godt av 96-brønns plate å tillate evaluering av konsekvent spill og variasjon. Så får hver en annen sonde. Etter signal utvikling, er embryo eller vev fra hver brønn plassert på individuelle objektglass for mikroskopisk analyse.
Bruk av tyramide signalforsterkning (TSA) for sonden oppdagelsen gir robust signaler med eksepsjonell subcellular oppløsning 5,6,7,8. Den subcellular lokaliseringen av RNAs er en viktig regulatoriske mekanisme 9 til oppstå med nesten alle RNAs 4,10,11. Disse analysene har også vist at mange utskrifter som ikke gjenkjennes av RNA-seq er lett oppdaget av fisk 8. Tilpasning av RNA i situ hybridisering til 96-brønns plater tillater analyse av opptil 96 gener rundt på en tid (mer hvis flere plater brukes), gjør analyse av store datasett mulig. Ved å kutte plater i mindre deler, er metoden også tilpasset til bare noen få eksempler. Protokollen gitt er egnet for analyse av RNA distribusjoner i de fleste typer vev. Selv ikke vises, er det tilpasses ikkeDrosophila vev.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td>
			<td>Biomart (Canada)</td>
			<td>141106-1K</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>MSBVS1210</td>
			<td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate (200 &#956;l)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C18096-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH&#8322;O and 0.2&#956;m filtered (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P96-450V-C</td>
			<td>To store bacterial glycerol stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-PCR-AS-200</td>
			<td>To seal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-T205-WB-C</td>
			<td>To transfer samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>200062156</td>
			<td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &#956;g/ml or 1/400 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td>
			<td>BrandTech Scientific Inc.</td>
			<td>704526</td>
			<td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&#956;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2522</td>
			<td>Antifade reagent in mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Working concentration is 0.1 % in ddH&#8322;O. To make RNase free water 0.1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-uridine-5&#8217;-triphosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-209-256-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5804</td>
			<td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>FOR001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY002.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>DiaMed</td>
			<td>LAA42370-001</td>
			<td>Fill in heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-347</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 100 micons</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>57-103</td>
			<td>For collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 800 microns</td>
			<td>SEFAR - Nytex</td>
			<td>06-780/53</td>
			<td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>Size: 22 X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slides,frstd</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Size: 25 X 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>P/N 5017</td>
			<td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PAR070.500</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model: DNA Engine PTC-200</td>
			<td>96-well plate PCR and probe denature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picric acid solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>80456</td>
			<td>For tissue fixation I solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCL)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH&#8322;PO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PPM302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P-LID-PP</td>
			<td>Lid for storing plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>825-1-50-5S</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>87-CFILM-AL</td>
			<td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P2308- 5MG</td>
			<td>Embryo permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977015-500ml</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Remove RNase contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single stranded DNA from salmon testes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D9156</td>
			<td>For hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk (non fat power)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SKI400.500</td>
			<td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA333</td>
			<td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (HOC(COONa)(CH&#8322;COONa)&#8322; &#183; 2H&#8322;O</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td>Reagent in 20 X SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na&#8322;HPO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.1</td>
			<td>Reagent in 10 X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0131</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259-274.</td>
			<td>To fill the heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope &#38; gooseneck light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ6</td>
			<td>Tissue dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S911</td>
			<td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &#956;g/ml) for in situ.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0101</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0111</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (10 ul)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-STK-S</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (200 ul)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>27770T</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips ( 1ml)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>10200</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TRX506</td>
			<td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHA1003917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH&#8322;O (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH&#8322;O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (80 g), KCL (2 g), Na&#8322;HPO&#8324; (14.4 g), KH&#8322;PO&#8324; (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

Inne våre anstrengelser å finne mønstre av uttrykk og subcellular lokalisering av Drosophila RNAs på genomet-bred basis, og i en rekke vev, har vi utviklet mange endringer og forbedringer til vår opprinnelige fluorescerende på stedet hybridisering (fisk)-protokollen. For å lette gjennomstrømming og kostnadene effektivitet, utføres alle trinnene, fra sonden generasjon til signalet oppdagelsen, bruker ekson 96-brønnen microtiter plater. Digoxygenin (graver)-merket antisense RNA sonder er produsert med cDNA kloner eller genomisk DNA som maler. Etter vev fiksering og permeabilization, sonder er hybridiserte til utskrifter av interesse og deretter oppdaget ved hjelp av en rekke anti-grave antistoff konjugert til biotin, streptavidin konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) og fluorescently konjugert tyramide, som i nærvær av HRP, produserer en svært reaktive mellomliggende som binder til elektron tett regioner i umiddelbar nærhet av proteiner. Følgende forsterkning og lokalisering produsere et robust og svært lokaliserte signal som forenkler både mobilnettet og subcellular transkripsjon lokalisering. Protokollene gitt har blitt optimalisert for å produsere svært spesifikke signaler i en rekke vev og utviklingsstadier. Referanser tilbys også for flere varianter som tillater samtidig påvisning av flere utskrifter, eller utskrifter og proteiner, samtidig.

Figur 6 viser eksempler på resultatene ved hjelp av denne fremgangsmåten. Topp 3 panelene viser eksempler på tidlig Drosophila embryo (figur 6, paneler vekselstrøm), det neste 3 paneler viser eksempler sen Drosophila embryo med signaler i ulike vev (amnioserosa, muskler og sentralnervesystemet, henholdsvis (figur 6, paneler D-F). Neste er eksempler fra 3dje skikkelsen larver vev (figur 6, paneler G-J). Paneler K og L Vis representant bilder fra voksen gonader (eggstokken og testikkel, henholdsvis). Hundrevis av bilder har blitt lastet opp og kommenterte i vår søkbare fluorescerende i situ frukt fly database (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Figur 1. Omrisset av fluorescerende i situ hybridisering (fisk) protokollen nøkkel utstyr og. (A) PCR forsterkning av cDNA. (B) In vitro transkripsjon generere gen-spesifikke antisense grave - merket RNA sonder i en 96-brønns plate (Foto av platen vises i b). (C) og (D): voksne (kvinnelig: mannlige forholdet 2:1. 300-400 fluer/flaske) flyr tillates å mate i 3-4 dager. Embryoer fra en overnatting samling på standard cornmeal mat ved 25 ° C er overført til en godt ventilert plasteske (1 L cornmeal mat i en container størrelse: 8 "X 8" X 3" LWH) eller nye flasker holder en lated larver tetthet. Vev samling, bør aktiv gjær pulver stenket på maten på 24, 48 timer etter egglegging (jel). (E til H): Fluorescerende i situ hybridisering eksperimenter utført over 3 dager. Embryo eller vev som ikke flyte, bruke en 96-brønns PCR plate som vist på bilde b med 8-kanals aspirator (bilde c). For vev som flyter, som de fleste larver vev, bruke en filter bunn plate (bilde i d) og fjern væsken fra bunnen med en manifold aspirator ved hjelp av lavtrykk (bilde i e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figur 2. Fastsettelse av RNA sonde avkastning. Nylig syntetisert antisense RNA sonder observert på en 1% agarose gel (5 µL/lane). Avkastningen kan kategoriseres (basert på intensiteten av bandet) som "lav yield" i baner 3 og 10, typisk avkastning i baner 1, 4, 5, 6 og 8 eller "høy avkastning" i kjørefelt 2, 7, 9, 11 og 12. For eksempler med 'typisk gir' bruk 10-15 µL av sonden fortynnet i 100 µL av hybridisering løsning for hvert i situ eksperiment. Fortynne prøver med "høy avkastning" av sonde med ekstra hybridisering løsning ifølge bandet intensiteten i forhold til en "typisk sonde" intensitet. Mål å ha omtrent lik siste sonde konsentrasjoner i hver brønn. Pilen peker til en av 'RNA sonder', høyere bandet på hver bane er den opprinnelige DNA-malen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figur 3. Store trinnene for en storstilt embryoet samling og fiksering. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figur 4. Hjemmelaget rør for å fjerne væske fra larver eller flytende vev. Noen larver og voksne vev flyter i løsningen under fiksering. Dette enkle verktøyet består av en nylon maske holdt av en 200 µL kutte spissen, fulgt av en 1 mL-tips som en adapter til å koble til en aspirator. Flytende kan trygt fjernes uten å miste noen vev. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figur 5. Tyramide Signal forsterkning. (1) grave-merket antisense RNA sonde arten endogene følelse RNA. (2) Immuno-affinitet binding mellom biotin-konjugerte primære antistoff og grave-UTP. (3) HRP konjugert streptavidin binder biotin. (4) HRP gir cyanine 3-tyramide og hydrogen peroxide reaksjonen å danne kortvarig cyanine 3-tyramide radikaler. (5) cyanine 3-tyramide radikaler binde til tyrosin rester på nærliggende proteiner. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Figur 6. Representant i situ hybridisering bilder. Hvert panel viser et eksempel på en annen RNA (vist i Cyan) og kjerner med DAPI (vises i rødt). (A-C) Eksempler på tidlig Drosophila embryo. (D, F) Eksempler på slutten Drosophila embryoer. (G-J) Eksempler på 3rd skikkelsen Drosophila larver vev (malphigian tubuli, midttarmen, salivary kjortelen og muskel henholdsvis). (K) voksen eggstokken. (L) voksen testikkel. Hvert panel viser navnet på genet som sonden er hybridizing til. Skalere barer = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Beskrevet RNA i situ hybridisering protokollen tillater påvisning av RNA i hele Drosophila embryo eller dissekert vev. Bruke 96-brønnen microtiter plater og tyramide signalforsterkning, kan utskrifter oppdages ved høy oppløsning og følsomhet gjennomstrømming og en relativt lav kostnad.

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Research

JoVE Journal

Genetics

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Merking av mitokondriell DNA replikasjon i Drosophila voksen Eggstokkene Edu Farging

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høy fett diett fôring og høy gjennomstrømning Triacylglyceride analysen i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Bruk av ett molekyl fluorescerende i Situ hybridisering (SM-fisk) å kvantifisere og Localize mRNAs i Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Kromogen in situ hybridisering SS et verktøy for HPV-relaterte hode og nakke kreftdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Designing automatisert, høy gjennomstrømming, kontinuerlig cellevekst eksperimenter bruke eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...