Name: high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification at JoVE.com

Fondos para este proyecto fue proveído por una beca a HMK por los institutos canadienses de salud investigación (concesión 133473 fregona).

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li><li>Hughes, S. C., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+labeling+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+Drosophila+whole-mount+embryos.">Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos.</a> Biotechniques. 24, 530-532 (1998).</li><li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function.">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Raap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-sensitive+FISH+using+peroxidase-mediated+deposition+of+biotin-+or+fluorochrome+tyramides.">Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides.</a> Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).</li><li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , 1-9 (2010).</li><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+Localization+in+Animal+Cells+and+Why+It+Matters.">Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Martin, K. C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Localization:+Gene+Expression+in+the+Spatial+Dimension.">mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension.</a> Cell. , 719-730 (2009).</li><li>Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+and+pervasive+subcellular+distributions+for+both+coding+and+long+noncoding+RNAs.">Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs.</a> Genes Dev. 30, 594-609 (2016).</li><li>Zhou, X. L., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+kidney+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules.</a> Dev Biol. 271, 322-338 (2004).</li></ol>

Autores tienen intereses financieros que compiten.

El protocolo descrito proporciona un método altamente reproducible, sensible y económico para la detección de ARN más en fijos Drosophila embriones o tejidos. Aunque un poco más complicado que el más tradicionalmente utilizan método de fosfatasa alcalina de la detección de la sonda, la resolución obtenida por los peces es mucho mayor y la sensibilidad es comparable o mejor 7,8. Utilizando placas de microtitulación total o parcial, pueden utilizarse los protocolos de análisis a gran escala o limitados de genes de interés. Cabe señalar que las puntas de prueba generados pueden detectar todos o empalme de transcripción múltiples formas a menos que las puntas de prueba están diseñados más específicamente (es decir, solo exones). Aunque hemos probado tan pequeñas como 200 nucleótidos con razonable éxito de sondas, sondas más pequeñas suelen ser menos efectivas y pueden ser menos específicas. Claramente, este Protocolo no es apropiado para la detección de pequeños intrones, exones, o procesado microRNAs.
Aunque este enfoque utiliza un paso enzimático para aumentar la fuerza de las señales, intensidad de la señal parece ser proporcional a la expresión del gen Diana en una relativamente lineal y amplia gama de niveles de expresión. A mayor aumento, la señal se ve como orificio o puntos dentro de las células y tejidos. Para transcripciones relativamente raras se ven solo unos orificio pequeño. Medida que aumenta la abundancia de transcripción, estos crecen en número y tamaño. Como sola molécula peces (smFISH), único orificio pequeño puede corresponder también a RNAs sola y debe también ser fácilmente cuantificado utilizando el software de la proyección de imagen y la informática. Comparaciones de imágenes publicadas obtenidas mediante smFISH con imágenes que nos hemos curado para los objetivos de la misma sugieren que la general, la sensibilidad y la resolución de los dos métodos son relativamente similares, aunque esto debe ser probado por comparaciones más rigurosas. Teniendo en cuenta el gasto mucho más alto de smFISH, el método que aquí debe dar resultados similares a una fracción del costo. Sin embargo, si el objetivo es detectar pequeñas transcripciones o partes distintas de las transcripciones, se recomienda smFISH.
Debido al menor tamaño de algunas sondas FISH, este método también puede ser mejor para penetrar los tejidos que son grandes o que tengan barreras significativas. Sin embargo, el uso de mayores niveles de detergente y ajustes fijación y permeabilización del tejido parece que han solucionado este problema. Por último, aunque desarrollado para los tejidos de la Drosophila , los buffers detergentes alta aquí descritos para los tejidos disecados también deberían funcionar para los tejidos, así como la mayoría otros organismos y embriones de Drosophila .

Nuevos métodos de detección del RNA del genoma como RNA-seq han expandido enormemente nuestro conocimiento de Cuándo y dónde se expresan los genes y en qué niveles1. Sin embargo, estos ofrecen relativamente pobre resolución temporal y espacial. RNA el hibridación in situ permite la distribución espacial de las transcripciones para ser observada visualmente en los tejidos fijos, revelando así los detalles de la localización celular y subcelular2. Mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) permite más resolución espacial que permite el uso de técnicas de microscopía de gran alcance, tales como microscopia de confocal y luz la hoja3. Marcadores fluorescentes como DAPI pueden utilizarse también para establecer relaciones subcelulares4. PECES también facilita la observación de varios RNAs y proteínas al mismo tiempo con claras indicaciones de superposición en el nivel subcelular. Únicos reactivos y pasos necesarios para el etiquetado doble pueden encontrarse en las siguientes referencias3,5.
Los procedimientos descritos aquí utilizan las placas de microtitulación de 96 pozos para todos los pasos, incluyendo la producción de la plantilla de cDNA (colony PCR), producción de sonda de RNA (con transcripción de escorrentía dependiente de la polimerasa T7, T3 o SP6), hibridación in situ , y desarrollo de la señal fluorescente. Un número suficiente de embriones o tejidos se agregó a cada pozo de la placa de 96 pocillos para permitir la evaluación de consistencia y variabilidad. Pues bien, cada uno recibe una sonda diferente. Después del desarrollo de la señal, embriones o tejidos de cada pozo se vistió en portaobjetos individuales para el análisis microscópico.
El uso de amplificación de la señal de tyramide (TSA) para la detección de la sonda produce señales robustas con excepcional resolución subcelular 5,6,7,8. La localización subcelular de RNAs es un importante mecanismo regulador 9 que parece ocurrir con casi todos RNAs 4,10,11. Estos análisis también han mostrado que muchos expedientes que no son detectados por RNA-seq son fácilmente detectados por peces 8. La adaptación de RNA en situ hibridación para placas de 96 pocillos permite el análisis de genes hasta 96 de interés en un momento (se utilizan más si más placas), posibilitando el análisis de grandes conjuntos de datos. Cortando las placas en secciones más pequeñas, el método se adapta fácilmente a pocas muestras. El protocolo siempre es apropiado para el análisis de distribuciones de RNA en la mayoría de los tipos de tejidos. Aunque no se muestra, es adaptable a no - tejidos deDrosophila así.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB15-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene)</td>
			<td>Biomart (Canada)</td>
			<td>141106-1K</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>MSBVS1210</td>
			<td>Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate (200 &#956;l)</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C18096-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.2 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter (0.45 u)</td>
			<td>PALL</td>
			<td>PN4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A9393-5G</td>
			<td>Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH&#8322;O and 0.2&#956;m filtered (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN 96-well assay storage plates</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P96-450V-C</td>
			<td>To store bacterial glycerol stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Aluminum Plate Seals</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-PCR-AS-200</td>
			<td>To seal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-T205-WB-C</td>
			<td>To transfer samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Lab</td>
			<td>200062156</td>
			<td>Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 &#956;g/ml or 1/400 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND 8-channel manifold (autoclavable)</td>
			<td>BrandTech Scientific Inc.</td>
			<td>704526</td>
			<td>To remove liquids from the top of 96-well PCR plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2&#956;m filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA)</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D2522</td>
			<td>Antifade reagent in mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>Working concentration is 0.1 % in ddH&#8322;O. To make RNase free water 0.1 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-uridine-5&#8217;-triphosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-209-256-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5804</td>
			<td>Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>FOR001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY002.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLN001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4784-250MG</td>
			<td>Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H&#8322;O&#8322;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>DiaMed</td>
			<td>LAA42370-001</td>
			<td>Fill in heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-347</td>
			<td>Sample mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 100 micons</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>57-103</td>
			<td>For collecting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh - 800 microns</td>
			<td>SEFAR - Nytex</td>
			<td>06-780/53</td>
			<td>For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>Size: 22 X 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slides,frstd</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Size: 25 X 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Well Plate Vacuum Manifold</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>P/N 5017</td>
			<td>Remove liquid from bottom of 96-well filter plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd (PFA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PAR070.500</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model: DNA Engine PTC-200</td>
			<td>96-well plate PCR and probe denature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picric acid solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>80456</td>
			<td>For tissue fixation I solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCL)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH&#8322;PO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PPM302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP lid for 96-well plates, 100/case</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>24-P-LID-PP</td>
			<td>Lid for storing plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile)</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>825-1-50-5S</td>
			<td>Liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progene Pierceable Aluminum Foil</td>
			<td>UltiDent Scientific</td>
			<td>87-CFILM-AL</td>
			<td>Seal 96-well plate, DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P2308- 5MG</td>
			<td>Embryo permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277057001</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977015-500ml</td>
			<td>RNA probe sythesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Remove RNase contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single stranded DNA from salmon testes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D9156</td>
			<td>For hybridization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk (non fat power)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SKI400.500</td>
			<td>Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA333</td>
			<td>Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate (HOC(COONa)(CH&#8322;COONa)&#8322; &#183; 2H&#8322;O</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td>Reagent in 20 X SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na&#8322;HPO&#8324;)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPD307.1</td>
			<td>Reagent in 10 X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0131</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Shot for Sand Bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13259-274.</td>
			<td>To fill the heating unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope &#38; gooseneck light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model: MZ6</td>
			<td>Tissue dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S911</td>
			<td>Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 &#956;g/ml) for in situ.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0101</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EP0111</td>
			<td>20 Unit/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (10 ul)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-STK-S</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip station (200 ul)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>27770T</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips ( 1ml)</td>
			<td>Sorbio</td>
			<td>10200</td>
			<td>Certified DNase and RNase free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TRX506</td>
			<td>Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td>Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper, Grade 3</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHA1003917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH&#8322;O (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH&#8322;O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (80 g), KCL (2 g), Na&#8322;HPO&#8324; (14.4 g), KH&#8322;PO&#8324; (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH&#8322;O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTT (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X PBTTB (1L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % Skim milk in 1 X PBTT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution fluorescent in situ hybridization in drosophila embryos and tissues using tyramide signal amplification

En nuestros esfuerzos para determinar los patrones de expresión y localización subcelular de Drosophila RNAs en todo el genoma y en una variedad de tejidos, hemos desarrollado numerosas modificaciones y mejoras a nuestro fluorescente original in situ protocolo de hibridación (FISH). Para facilitar el rendimiento y la rentabilidad, se realizan todos los pasos, desde la generación de la sonda de detección de señal, utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos de exón. Digoxygenin (Cave)-sondas con antisense RNA son producidas utilizando clones de cDNA o DNA genomic como plantillas. Después de la fijación del tejido y permeabilización, sondas son hibridadas de las transcripciones de interés y luego detectado usando una sucesión de anticuerpos anti-DIG conjugado con biotina, estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) y conjugado fluorescente tyramide, que en presencia de HRP, produce un intermediario altamente reactivo que se une a regiones densas del electrón de proteínas inmediatamente adyacentes. Estos pasos de localización y de amplificación producen una señal robusta y altamente localizada que facilita tanto localización celular y subcelular de la transcripción. Los protocolos proporcionados han sido optimizados para producir señales muy específicas en una variedad de tejidos y etapas de desarrollo. Para variaciones adicionales que permiten la detección simultánea de múltiples transcripciones, o transcripciones y proteínas, al mismo tiempo, dispones de referencias.

La figura 6 muestra ejemplos de los resultados obtenidos usando este procedimiento. Los paneles superiores 3 muestran ejemplos de embriones de Drosophila tempranos (figura 6, paneles A-C), el próximo 3 paneles muestran ejemplos de embriones de Drosophila con señales en diferentes tejidos (amnioserosa, músculos y sistema nervioso central, respectivamente (figura 6, paneles D-F). A continuación son ejemplos de estadio 3 tejidos larvales (figura 6, los paneles de G-J). Paneles de K y L muestran imágenes representativas de adultos gónadas (ovario y testículo, respectivamente). Cientos de imágenes se han subido y anotado en nuestra página 'fluorescente en situ mosca de la fruta base de datos' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg"> 
Figura 1. Esquema de fluorescente en situ del hibridación (pescado) protocolo clave equipo y. (A) amplificación PCR de cDNA. (B) In vitro transcripción para generar específicos de gen antisentido DIG - etiquetado de sondas de RNA en una placa de 96 pocillos (foto de la placa que se muestra en b). (C) y (D): adultos (hembra: relación hombre 2:1. 300-400 moscas/botella) moscas se les permite aparearse durante 3-4 días. Embriones de una colección durante la noche alimentos de harina estándar a 25 ° C se transfieren a una caja de plástico bien ventilada (1 L de alimentos de harina de maíz en un recipiente de tamaño: 8 "X 8" X 3" LWH) o a nuevas botellas, mantener una adecuada densidad larvaria. Para la colección de tejidos, polvo de levadura activa debe ser asperjado sobre los alimentos a las 24, 48 h después de la postura (AEL). (E a H): Fluorescente en situ hibridación experimentos realizados durante 3 días consecutivos. Para embriones o tejidos que no flotan, utilice una placa de PCR de 96 pocillos como se muestra en la fotografía b con aspirador de 8 canales (foto c). Para los tejidos que flotan, como la mayoría de los tejidos larval, utilice una placa de filtro de fondo (foto d) y eliminar el líquido desde la parte inferior con un aspirador colector de baja presión (foto e). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg"> 
Figura 2. Determinación del rendimiento de la sonda de RNA. Recién sintetizado sondas antisense RNA observadas en gel de agarosa 1% (5 μl/carril). El rendimiento se puede categorizar (basado en la intensidad de la banda) como 'rendimiento bajo' en rutas 3 y 10, rendimiento de típico en los carriles 1, 4, 5, 6 y 8, 'alto rendimiento' en pistas 2, 7, 9, 11 y 12. Para muestras con 'típicos rendimientos', utilice 10-15 μl de la sonda diluir en 100 μl de solución de hibridación para cada experimento en situ . Diluir las muestras con 'alto rendimiento' de la sonda con solución de hibridación adicional según la intensidad de la banda en relación con la intensidad de un 'típico ' de la sonda. Objetivo tienen concentraciones de aproximadamente igual probe final en cada pozo. La flecha señala a una de las sondas de RNA la banda superior de cada carril es la plantilla original de ADN. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg"> 
Figura 3. Principales pasos para una colección de embriones en gran escala y de. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg"> 
Figura 4. Tubo casero para eliminar el líquido de los tejidos larvales o flotantes. Algunos tejidos larvales y adultos flotan en solución durante la fijación. Esta sencilla herramienta consiste en una malla de nylon por una 200 μL cortar la punta, seguido por una punta de 1 mL como un adaptador para conectar a un aspirador. Líquido se puede quitar sin perder cualquier tejido. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg"> 
Figura 5. Amplificación de la señal de Tyramide. (1) sonda de RNA antisentido DIG marcado se hibridiza con sentido endógeno RNA. (2) inmuno afinidad de unión entre anticuerpo primario conjugado con biotina y DIG-UTP. (3) HRP había conjugado estreptavidina biotina de ATA. (4) HRP cataliza la reacción de Cianina 3-tyramide y peróxido de hidrógeno para formar a radicales de breve duración Cianina 3-tyramide. (5) radicales de Cianina 3-tyramide se unen a residuos de tirosina en proteínas cercanas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg"> 
Figura 6. Representante en situ imágenes hibridación. Cada panel muestra un ejemplo de un RNA diferentes (mostrado en cian) y núcleos teñidos con DAPI (mostrado en rojo). (A-C) Ejemplos de los primeros embriones de Drosophila . (D, F) Ejemplos de finales embriones de Drosophila . (G-J) Ejemplos de 3er instar tejidos de larvas de Drosophila (túbulos malphigian del midgut, glándulas salivales y el músculo respectivamente). (K) ovario adulto. (L) testículo adulto. Cada panel muestra el nombre del gen que la sonda se cruza por hibridación a. Barras de la escala = 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

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Research

JoVE Journal

Genetics

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