Name: optical screening of novel bacteria-specific probes on ex vivo human lung tissue by confocal laser endomicroscopy
Uploaded: 2017-11-29T13:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить инженерии и физическим научным исследованиям Совета (EPSRC, Соединенное Королевство) междисциплинарных исследований сотрудничестве Грант EP/K03197X/1, Департамент здравоохранения и Уэллком траст через фонд инноваций вызов здравоохранения (HICF) . Финансирования номер: 0510-069.

<ol>
	<li>Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust Available from: <a target="_blank" href="https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf">https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf</a> (2016)</li><li>Caliendo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+Tests,+Better+Care:+Improved+Diagnostics+for+Infectious+Diseases.">Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases.</a> Clin. Infect. Dis. 57, 139-170 (2013).</li><li>Zumla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point+of+care+diagnostic+tests+for+viral+and+bacterial+respiratory+tract+infections-needs,+advances,+and+future+prospects.">Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects.</a> Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).</li><li>Neumann, H., Kiesslich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Yamada's Textbook of Gastroent. , 2944-2949 (2015).</li><li>Chauhan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy.">Confocal laser endomicroscopy.</a> Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).</li><li>Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+in+endoscopy:+endomicroscopy+and+endocytoscopy.">Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).</li><li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+endomicroscopy+for+non-invasive+head+and+neck+cancer+imaging:+A+comprehensive+review.">Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review.</a> Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).</li><li>Thiberville, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+in+vivo+fluorescence+microimaging+of+the+alveolar+ducts+and+sacs+during+bronchoscopy.">Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy.</a> Eur Respir J. 33, (2009).</li><li>Thiberville, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+endomicroscopy+of+the+human+airways.">Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways.</a> Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).</li><li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+bacterial+infections.">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).</li><li>Akram, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+labelled-ubiquicidin+antimicrobial+peptide+for+immediate+in+situ+optical+detection+of+live+bacteria+in+human+alveolar+lung+tissue.">A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue.</a> Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).</li><li>Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+ecology+of+the+lung:+new+conceptual+models+of+pulmonary+microbiology+and+pneumonia+pathogenesis.">Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis.</a> Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).</li><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li><li>Magiorakos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+carbapenem+resistance+in+Europe:+just+the+tip+of+the+iceberg.">The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).</li><li>Chastre, J., Fagon, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilator-associated+Pneumonia.">Ventilator-associated Pneumonia.</a> Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).</li><li>Krstaji&#263;, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+widefield+fluorescence+microendoscopy+enables+multiplexed+molecular+imaging+in+the+alveolar+space+of+human+lung+tissue.">Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue.</a> J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).</li></ol>

КД: Основатель директор Эдинбург Молекулярное воображение. Полученные консультации от Мауна-Кеа технологий как советник.
МБ: Основатель директор Эдинбург Молекулярное воображение.

Инфекции нижних дыхательных путей учета вторым наибольшим бременем болезней глобально12,13и существенное увеличение число инфекций, приписываемых антимикробные резистентных бактерий был сообщил14. Пневмония остается наиболее распространенная причина госпитализации. В реанимации развитие пневмонии осложняется диагностических неопределенности и связано с чрезвычайно высокой смертности показатель15. Во время наступления пневмонии бактерии размножаются в альвеолярной пространстве дистальной части легкого, область, которая является относительно стерильные, с минимальными микрофлору в области здравоохранения.
Этот метод описывает относительно поздней стадии ex vivo проверки бактерии конкретных оптических изображений зонды11, но дизайн, синтез, и зонд оценки до начала этот шаг проверки важно, как ранее показанного11 .
"КЛЕ" является формирующейся клинических техника для допроса болезни государства на месте в режиме реального времени. Он предлагает много преимуществ над традиционными методами для расследования предполагаемых легочной патологии, которая может включать биопсии и сбора жидкости промывания. Биопсии инвазивных и может привести к заболеваемости и смертности в вентилируемых пациентов, и собранные промывание жидкость часто бывает загрязнена бактерий из верхних дыхательных путей. "КЛЕ" в обнаружении пневмонии используется однако несколько ограничено из-за плохой наличие совместимых изображений датчики, которые могут предоставить функциональные сведения заболевания, несмотря на многие согласованные усилия10. Предлагает сочетание ДЗ с оптическим агенты перспективы диагностики пневмонии быстрее и меньше вмешательства по сравнению с текущей стандартной практикой.
В пробоподготовки и установки платформы "КЛЕ" критические шаги к настоящему Протоколу. Получение тканей человека отношение к окончательной клиническое применение также важна, как человека легочной ткани, как продемонстрировано в рамках этого исследования. Это необходимо для использования тканей человека, потому что степень ткани аутофлюоресценция показывает большие различия между видами и поэтому может ввести в заблуждение чувствительность бактерии зонд изображаемого. Кроме того важно получение этики для поиска и использования человеческого легочной ткани. От технического уровня, правильной очистки, вложение изображений волокна в LSU платформа, и калибровки имеет важное значение для хорошего разрешения и последовательной обработки изображений, как обеспечение эквивалентного количества бактерий добавляются для каждого образца ткани легких. Для дальнейшего расширения полезности этого метода для проверки панели датчиков, повторяя процедуру с спектр патогенов, таких как те, вероятно, будет возбудителей пневмонии является необходимым.
Крупнейший ограничением этой методики является, что клинически утвержденных CLE устройство имеет только один лазерный (488 нм). Таким образом в настоящее время, выбор Флюорофор для Конструкция зонда ограничен для использования с этой системой, хотя клинически утвержденных одного цвета, которую устройства существуют с длинами волн возбуждения 660 нм и ближней ИК-области спектра. Весьма желательно иметь второй линии лазерного реализовано в рамках того же устройства, чтобы зонд с спектрально собственный Флюорофор для повышения чувствительности бактерий зонд над уровнем аутофлюоресценция ткани. Хотя двухцветный CLE устройства находятся в стадии разработки, либо они утверждаются не клинически и/или их стоимость значительные16.
"КЛЕ" в пробирке с использованием патогенных бактерий и ex vivo человека легочной ткани на экране потенциальных зонды ликвидирует разрыв между обычными в vitro методы, такие как проточной цитометрии и CLSM и клинической полезности. Этот шаг предлагает доверие при выборе перспективных соединений для продвижения вперед в сочетании с клинической CLE изображений; и даст указание ли проверенный зонд поддерживает целевую специфику, или демонстрирует любой пробить маркировки, например привязку непосредственно к ткани, или показывает нестабильность с принимающей протеолитических ферментов. Было бы также целесообразно добавить каждый из доступных зондов непосредственно образцы человеческого легочной ткани плюс бактерий, полностью характеризовать скорость зонда привязки и активации в режиме реального времени.
Мы считаем, что наш трубопровод для быстрого скрининга Роман бактерии конкретных зонды оценить их потенциал для обработки изображений в дистальной легких пациентов приведет к гораздо быстрее перевод в клинику. Это главным образом потому, что бактерии конкретных зонд может быть доставлено локально в легких через катетер, вставлен вниз рабочий канал бронхоскоп, означает, что microdose (< 100 мкг) суммы может быть доставлено. Таким образом системные поставки и накопление этого соединения является не является проблемой, как в случае многих других целей инфекции в теле, или с ядерными изображений. Кроме того, обеспечивая изображений зонд в такой небольшой дозы уменьшает риск токсичности связанных осложнений (хотя для перевода потребуется токсичности скрининга). После инстилляции зонда катетер может затем быть заменена FCFM волокна и того же региона легких, допрашивали "КЛЕ", так же, мы провели в этом методе. Изображения должны быть выполнены быстро после установки зонда перед зонд смывает обнаружить концентрации.
Важно также отметить, что Скрининг болезней выявление зонды, эта техника не должна быть ограничена агентов бактериальной изображений, но может также распространяться на проверки датчиков с альтернативных целей, таких как воспаление. Этот подход должен также быть адаптированы для других заболеваний места в тексте, где допустимо изображений через FCFM.

Этот метод описывает процесс быстрого скрининга для оценки бактерии конкретных оптических изображений агентов в рамках ex vivo человека легочной ткани, "КЛЕ", с помощью FCFM для быстрой идентификации соединений с потенциальными клинической полезности для визуализации бактерии в дистальной легких в situ.
Существует неотложных глобальных требование рацион антимикробной назначения в эпоху роста резистентности к противомикробным препаратам1. С этой целью разработки диагностических методов, которые действуют для определения бактериальной инфекции с высокой специфичностью, чувствительность и в режиме реального времени сильно стремились2. Существующие методы для подтверждения диагноза пневмоний у больных критически нездоровы, например в рамках интенсивной терапии (палаты интенсивной терапии), часто полагаются на интерпретации неспецифические клинические или радиологических функции наряду с бактериальной культуры техники от атмосферный жидкости/тканей, которые может занять до 3 дней для получения результатов. Кроме того бактериальной культуры от жидкости воплощено в дистальной легких и извлечь подвержен загрязнению от более проксимальном airways3 и часто культура отрицательные вследствие сопутствующего антибактериальной терапии или методов бедных выборки. Кроме того молекулярные методы, такие как полимеразной цепной реакции слишком чувствительны, когда используется на атмосферный жидкости, рискуя перенасыщению больных. Новые диагностические подход является молекулярный оптических изображений, что делает в situ молекулярной патологии тканей возможность; Однако требуется разработка и проверка соединений оптических изображений. Тем не менее прямой визуализации бактерий, через активируемых Оптические зонды потенциально очень мощный метод, чтобы разрешить изучение присутствия и эволюция пневмонии в пациента и, главное, могут использоваться для изучения взаимодействия хост возбудителя в ответ на лечение в реальном времени в.
"КЛЕ" является процедурой расследования в нескольких заболеваний4, включая в области гастроэнтерологии5,6,онкологии7и для допроса airways и альвеолярного мешки8, 9. Это позволяет точку ухода структурных изображений пораженной ткани, с использованием изображений bundle, который проходит через рабочий канал клинических эндоскопа волокно и форм прямой контакт с поверхности ткани, чтобы быть imaged confocal микроскопии. Однако одно ограничение, которое по-прежнему является необходимость универсального контрастного вещества. Таким образом использование конкретных зонды болезней, например определенных бактериальных агентов, может значительно расширить полезность этой модальности, непосредственно визуализации бактерий на месте предполагаемых инфекции. Оптическая агенты предлагают множество преимуществ перед другими методами, позволяя в реальном времени, с высоким разрешением изображения с диагностический потенциал. Кроме того оптические датчики предлагают перспективы мультиплексирования для допроса нескольких целей, все достигнутые при относительно низких затратах. Количество оптических агенты находятся в стадии разработки для этой цели, однако никто еще не были успешно осуществлены в рамках клиники10. Мы синтезированных библиотеки малых молекул химические датчики с специфичность к бактерии и разработали быстрого, эффективного трубопровода для оценки функции зонд для обнаружения бактериальной пневмонии на месте11.
Для выявления подходящего щупа кандидатов, пришлось быть выполнены до допроса зонда на ex vivo человека легочной ткани FCFM следующие условия: i) водный растворимость, ii) специфику и избирательности для быстро маркировки клинически соответствующих бактерий, iii) высокое соотношение сигнал шум и iv) стойкость к разложению в легких условиях. Последний был оценен Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF) от больных с острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), который является состоянием, которое характеризуется протеолитические и воспалительных сред в легких в реанимации. Кроме того зонды пришлось иметь подходящую Флюорофор для выявления клинически утвержденных оптических CLE изображений устройства в пределах человеческих легких альвеолярного ткани.
Трубопровод опросить каждого из этих предпосылок был следующим (на каждом этапе, только датчики, которые прошли были перенесены на следующий): (1) был синтезирован библиотека зондов должны расследоваться; (2) Каждый зонд был добавлен в группу живых бактерий для Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) для обеспечения бактериальных маркировки; (3) избирательность бактериальных маркировки над mammalian клеток в совместное культур с первичной нейтрофилов человека была учреждена CLSM; (4) стабильности и успешного маркировки бактерий в присутствии пациента ОРДС BALF определяется CLSM и матрица помощь лазерной десорбции/ионизации-время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии; (5) оптимальная концентрация кандидатов определяется CLSM, обеспечение селективности для бактерий над mammalian клеток была сохранена; (6) кандидатов были образы, FCFM в суспензии и ex vivo человека легких альвеолярного ткани для обеспечения стабильности и что сигнал шум был достаточным для обнаружения. Шаг 6 подробно рассматривается в рамках настоящего Протокола. Ранее сообщалось11была методология для шагов 1-5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1233px;" width="1233">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">1-14 Microfuge</td>
			<td style="width:263px;">SciQuip</td>
			<td style="width:119px;">90616</td>
			<td style="width:545px;">Small benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">96-well plate</td>
			<td style="width:263px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3370</td>
			<td style="width:545px;">Assay plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:263px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>17783&#160;</td>
			<td style="width:545px;">Commercial fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Cellvizio 488 nm Research CLE</td>
			<td style="width:263px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC-0001-488</td>
			<td style="width:545px;">Confocal laser endomicroscopy device</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Cletop-S</td>
			<td style="width:263px;">Cletop</td>
			<td style="width:119px;">14110601</td>
			<td style="width:545px;">Fibre cleaner</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Eppendorf (1.5 mL)</td>
			<td style="width:263px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30120086</td>
			<td style="width:545px;">1.5 mL microfuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Eppendorf Research Plus Pipettes</td>
			<td style="width:263px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11568663</td>
			<td style="width:545px;">Micro pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Falcon tube (50 mL)</td>
			<td style="width:263px;">Scientific Lab Supplies</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:545px;">50 ml centrifugation tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Gibco Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td style="width:545px;">PBS - wash media</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:307px;">IC-Viewer</td>
			<td style="width:263px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LW-0001</td>
			<td style="width:545px;">Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Incu-Shake midi</td>
			<td style="width:263px;">Sciquip</td>
			<td style="width:119px;">SQ-4020</td>
			<td style="width:545px;">Floor standing shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lysogeny Broth&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Sigma Aldrich (Miller)</td>
			<td>L3522</td>
			<td style="width:545px;">LB Growth media for S. aureus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">non-standard research AlveoFlex 488 nm</td>
			<td style="width:263px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td style="width:119px;">MP-0002-AF3</td>
			<td style="width:545px;">Fibred confocal fluorescence microscopy fibre</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Quanti Kit 488 nm</td>
			<td style="width:263px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LQ-0005</td>
			<td style="width:545px;">Calibration kit for the CellVizio 488 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">S. aureus ATCC 25923</td>
			<td style="width:263px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">25923</td>
			<td style="width:545px;">Bacterial strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Semi-micro spectrophotometry cuvette</td>
			<td style="width:263px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C5416-100EA</td>
			<td style="width:545px;">For spectrophotometry&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">Thermomixer comfort</td>
			<td style="width:263px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">41102422</td>
			<td style="width:545px;">Benchtop heater with shaking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:307px;">UV 1101 Biotech photometer</td>
			<td style="width:263px;">Biochrom WPA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:545px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical screening of novel bacteria-specific probes on ex vivo human lung tissue by confocal laser endomicroscopy

Улучшение скорости и точности обнаружения в бактериальные имеет важное значение для пациента стратификации и обеспечить надлежащее использование противомикробных препаратов. Для достижения этой цели, разработка методов диагностики признать бактериальное присутствие в режиме реального времени в момент ухода не требуется. Оптических изображений для прямой идентификации бактерий в пределах узла является привлекательным подход. Несколько попыток химических зонд конструкции и проверки были расследованы, однако никто еще не были успешно переведены на клинике. Здесь мы описываем метод для проверки ex vivo бактерий специфических преобразователей для идентификации бактерий в дистальной легких, отображаемого в расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM). Наша модель используется ex vivo человека легочной ткани и клинически утвержденных Конфокальная лазерная endomicroscopy (ДЗ) платформа для экрана Роман бактерии конкретных изображений соединений, тесно имитирует изображений условий, ожидается, что столкнулся с пациентами. Таким образом скрининга соединений, этот метод обеспечивает доверие потенциальных клинических уступчивость.

В этом исследовании мы продемонстрировали метод для быстрого скрининга Роман бактерии конкретных зондов в ex vivo человека альвеолярных легких тканей модели инфекции, используя устройство клинически утвержденных Кле.
"КЛЕ" по FCFM хорошо подходит для получения структурной информации в дистальной легких, как этот регион (из-за высокой обилие эластина и коллагена), естественно, весьма флуоресцентные, когда возбужденные с 488 нм лазер8. И наоборот альвеолярного пространства не флуоресцировать, и таким образом позволяет высокий контраст между структурой тканей и воздушным пространством быть визуализированы (рис. 1).
Добавление заболевания связанные с зондов или контраст агентов, таких как бактерии конкретных зондов должны позволить функциональная информация о процессах болезни, которые могут быть получены в режиме реального времени. Мы уже описали синтеза и первоначальный в пробирке скрининга библиотеки бактерий-конкретных зонды11; где бактерий специфика, было определено протеолитических стабильности и сохранения в пределах бактериальной мембраны с течением времени. Перспективным бактерии конкретных зонд (UBI-10) была определена в рамках этого исследования, а также один, что показали плохой удержания в бактериальных клеточных мембран (UBI-3). Они были по сравнению с элемент управления коммерческой counterstaining (Флуорексон AM), который был использован для помечены S. aureus.
Незапятнанное, Флуорексон AM, UBI-3 и помечены S. aureus UBI-10 были образы в суспензии, FCFM с 100% 488 нм лазер сила и частота кадров 12 кадров/сек (рис. 2). Там, где были образы немеченого бактерий в PBS, не флуоресцентные сигнал был обнаружению. Это отличается от того, когда были образы помечены бактерий. Там, где бактериальных суспензий с UBI-3 или UBI-10 были образы, FCFM, стало очевидно, что общий фон флуоресценции решения был повышен по сравнению с PBS только элементы управления, это потому, что NBD (зонд Флюорофор) выделяет небольшое количество флуоресценции сигнал в водном растворе, однако, яркие пунктата точки хорошо видны во всем решение, без необходимости мыть шага. Это объясняется увеличением флуоресценции сигнал, излучаемый NDB в полярной окружающей среды например, бактериальной мембраны. Флуорексон AM настолько не активируемых зонд, мыть шаг после бактериальной пятнать был обязан удалить высокой флюоресцентный фон несвязанных зонда в решении. Как UBI-3 и UBI-10 помечены бактерии, помечены Флуорексон утра были обнаружены в растворе FCFM как яркие зеленые точки пунктата. Поскольку данные собираются в видео формате, эти точки, как представляется, «Огонек», как они перемещаются между процессорными ядрами и из фокуса, характерной чертой изображений помечены бактерий этим методом.
Приклеенные этикетку бактерии впоследствии были добавлены небольшие кусочки ex vivo человека легочной ткани и снова imaged на FCFM (рис. 3). Где только неподписанных S. aureus или PBS был добавлен в легочной ткани, только структура autofluorescent ткани легких был обнаружен (рассматривать как яркие зеленые нити коллагена и эластина и темные участки альвеолярных пространства). Для этих условий управления обнаружены не пунктата точек. Аналогично только легких тканей структуры (и не пунктата точек) был визуализирован на состояние легких тканей с S. aureus плюс UBI-3; указав, что этот зонд не сохраняется стабильно в бактериальных клеток мембрана т.е., он был промыть и/или снижается в присутствии родной протеолитических ферментов в ткани легких (как ранее показали11).
Однако яркие пунктата точки были видны в обоих Флуорексон AM помечены положительный контроль S. aureus образца и с наиболее перспективных зонд бактерий конкретного образца (UBI-10) S. aureus . «Мерцающих» точки были видны несмотря на сильный ткани аутофлюоресценция (рис. 3). Таким образом результаты, полученные FCFM были в согласии с в vitro предварительной проверки группа бактерий специфических преобразователей, CLSM и продемонстрировал метод клинически значимых обнаружения для визуализации инфекции в режиме реального времени.
Результаты, представленные здесь продемонстрировать, что соответствующий орган системы для обработки изображений, FCFM из-за его отличительные аутофлюоресценция легких. Яркой отличительной структуры позволяют оператору "КЛЕ" определить, что они находятся в альвеолярной пространстве. Эти регионы, в сочетании с темной альвеолярного воздушные мешки обеспечивают идеальным фоном для визуализации дневно обозначенные бактерий с высокой контрастностью.
Хотя обнаружение бактерий, представленных в рамках этого исследования определяется качественно визуализации яркие пунктата точки, можно подсчитать количество пунктата точек кадра с помощью дополнительного программного обеспечения с целью дальнейшего характеризуют зонд библиотеки.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig1.jpg"> Рисунок 1: Статическое изображение человеческих легких тканей аутофлюоресценция. Конфокальный лазерный endomicroscopy (ДЗ) изображение ex vivo человека легочной ткани с помощью расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM), на 488 нм возбуждения, мощность лазера 100% и 12 кадров в секунду эластина и коллагена весьма флуоресцентные (false окрашен в зеленый цвет), в то время как альвеолярного пространство не является и отображается как черный регионов. Эта цифра была изменена от Акрама и др. 11 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig2.jpg"> Рисунок 2: Конфокальная лазерная endomicroscopy (ДЗ) изображение помечены Стафилококк золотистый в суспензии. Расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM) был использован для изображения предварительно помечены бактерий, 488 нм возбуждения, мощность лазера 100% и 12 кадров в секунду Приклеенные этикетку бактерий Показать как высоко флуоресцентные пунктата точки (ложные зеленого цвета). Эта цифра была изменена от Акрама и др. 11 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig3.jpg"> Рисунок 3: Конфокальная лазерная endomicroscopy (ДЗ) изображение ex vivo человека легочной ткани с метками S. aureus. Расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии (FCFM) был использован для изображения ex vivo человека легочной ткани и помечены S. aureus, 488 нм возбуждения, мощность лазера 100% и 12 кадров/s. Приклеенные этикетку бактерий шоу как высоко флуоресцентные пунктата точек (ложные цвета зеленый) в пределах образца ткани легких при помечены Флуорексон AM или UBI-10. Высокий контраст наблюдается, где бактерии отражаются в альвеолярной пространстве. Эта цифра была изменена от Акрама и др. 11 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy at JoVE.com

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Этот метод описывает процесс эффективный скрининг для оценки оптических изображений агентов бактерии конкретных внутри ex vivo человека легочной ткани, в расслоенных конфокальный флуоресцентной микроскопии для быстрой идентификации малых молекул химические зонд кандидатов с переводимые потенциалом.

Оптическая скрининг Роман бактерий-конкретных зонды на Ex Vivo человека легочной ткани, Конфокальная лазерная Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

Визуализация и количественной оценки внутриклеточного Взаимодействия Neisseria meningitidis И правам α-актинина по конфокальной микроскопии

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Экс естественных изображений Т-клеток у мышей фрагменты лимфатических узлов с Широкоугольные и конфокальной Микроскопы

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура клеток

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Инфекция

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Инфекции половых слизистой лимфоидной ткани человека и женщин с вирусом иммунодефицита человека 1 и Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...