Name: g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado por grant GM117446 NIH de A.B.

1. preparação de células para Flow Cytometry classificação
<ol><li>Inocular tubos de ensaio de 15 mL contendo 8 mL de caldo YEPD tal que as culturas atingem uma densidade de 5 x 106 a 1,5 x 107 células / mL após crescimento durante a noite (ver discussão Nota 1).</li>
	<li>Spin para baixo de células de levedura (1.400 x g, à temperatura ambiente ou 4 ° C) em um tubo de centrifugação de tampa de rosca 15 mL por 5 min, Ressuspender as células em 1,5 mL de etanol a 70% e transferir para...

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

Enquanto esta técnica é robusta e relativamente direta, deve ser prestada especial atenção ao seguinte:
(1) recomendamos que culturas crescem pelo menos 12 h antes que eles atinjam a fase de registo, desde que diferenças se manifestar no ciclo celular distribuições se culturas são colhidas após ter alcançado a densidade desejada apenas 4 h após a inoculação. Nossa suposição é que uma distribuição de ciclo celular que atingiu um equilíbrio relativamente estável melhor repres...

Replicação do genoma eucariótico é iniciada em vários locais discretos, chamados origens de replicação, de que a replicação garfos procedem em ambas as direções (revistas em Fragkos et al, 20151). Origens variam em seu tempo e a eficiência de queima, e várias técnicas foram desenvolvidas para monitorar a atividade de origem de replicação e elucidar as causas desta variação. A atividade de origens individuais pode ser inferida níveis de single-stranded DNA2, que se forma em torno de origens ativas, ou por meio de eletroforese em gel 2D para monitorar a replicação específico intermediários3, ambos os quais podem ser detectados com sondas radioactivas. Ambas estas técnicas são mais facilmente aplicadas em S. cerevisiae do que em células de mamíferos, porque origens limitam-se a sequências específicas de conhecido na antiga. Com o advento dos microarrays, tornou-se possível avaliar globalmente a disparar de origem. Isto foi feito primeiro pela rotulagem DNA com isótopos pesados, liberando as células de um bloco de G1 no médios contendo isótopos leves e monitoramento em seguida a formação de pesados-luz híbrido DNA através do genoma4. A introdução de sequenciamento de alto throughput permitiu semelhante genoma-monitoração de atividade de origem, sem a exigência de marcação isotópica caro. As células foram classificadas em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA e seu DNA submetido ao sequenciamento profundo. Porque a cobertura de sequência procede de 1x a 2x ao longo da fase S, sincronismo de replicação relativo pode ser avaliado comparando leitura profundidades de células em fase S àqueles em G1 ou G25,6. Estas técnicas, particularmente aplicadas à levedura, levaram a uma compreensão mais profunda de como sequência de DNA, estrutura da cromatina e DNA replicação proteínas regulam eficiência e sincronismo de origem.
Transmissão fiel da informação genética durante a proliferação celular requer não só sucesso iniciação da replicação do DNA, que se realiza às origens, mas também a conclusão bem sucedida da replicação, que ocorre onde encontram forquilhas de replicação. Como iniciação da replicação, o momento da conclusão da replicação varia consoante o genoma com certas regiões restantes replicadas no mesmo final do ciclo celular. Tais regiões podem ser particularmente distantes origens de replicação ativa ou podem conter sequências ou estruturas de cromatina que impedem as polimerases de DNA. Tarde, replicar as regiões pode se manifestar como sítios frágeis, que são associados com quebras cromossômicas e maiores taxas de mutação e têm sido implicados no cancro e o envelhecimento7,8,9. No entanto, apesar da importância da adequada conclusão da replicação do DNA na manutenção da estabilidade do genoma, nossa compreensão de onde e como isso ocorre tem lag muito atrás da iniciação da replicação. E enquanto os genes individuais cuja replicação final tem sido associada com doença têm sido estudados com, por exemplo, qPCR10, globais estudos dirigidos a elucidar as localizações e ultimamente tem faltado replicação de causas subjacentes. Aqui nós descrevemos uma técnica que chamamos como "G2 seq", no qual combinamos citometria de fluxo com sequenciamento de alto throughput para lançar luz sobre a conclusão da replicação do genoma em fermento11. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser adaptado a qualquer uma das células que pode ser de fluxo-classificados de acordo com o conteúdo de DNA.

<table width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">YeaStar Genomic DNA kit</td>
			<td style="width:135px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-323</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">1 &#181;M SYTOX Green</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">57020</td>
			<td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="width:301px;height:147px;">RNase solution (0.25 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R6513</td>
			<td style="width:167px;">0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:301px;height:42px;">proteinase K solution (20 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher / Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-015</td>
			<td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Model 50 Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>FB50A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">BD Biosciences FACSAria II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Zymo-spin III columns</td>
			<td style="width:135px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td>
			<td style="width:135px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">500219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>15026486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina HiSeq 2500 instrument</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>SY&#8211;401&#8211;2501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:301px;height:63px;">gsnap alignment software</td>
			<td style="width:135px;">open source software / Genentech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://research-pub.gene.com/gmap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

Inúmeras técnicas têm sido desenvolvidas para acompanhar o progresso da replicação do DNA através da fase S do ciclo celular. A maioria destas técnicas tem sido direcionada para elucidação do local e hora de início da duplicação do genoma, ao invés de sua conclusão. No entanto, é fundamental que nós entendemos de regiões do genoma que são última para concluir a replicação, porque essas regiões sofrem níveis elevados de quebra cromossômica e mutação, e eles têm sido associados com doenças e envelhecimento. Aqui descrevemos como nós estendemos uma técnica que tem sido usada para monitorar a iniciação de replicação para em vez disso, identificar as regiões do genoma última a replicação completa. Esta abordagem é baseada em uma combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento. Embora este relatório centra-se sobre a aplicação desta técnica a levedura, a abordagem pode ser usada com qualquer uma das células que pode ser classificada em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA.

Temos utilizado o procedimento descrito acima para identificar sites replicação finais no fermento de brotamento. Esta abordagem usando uma região de replicação final conhecida em um cromossomo artificial de teste provou a técnica para ser precisa e confiável. Nossos resultados também demonstraram a importância biológica da conclusão atempada da replicação, mostrando que uma tarde região replicam no cromossomo 7, que identificamos como replicação final com base nos nossos ...

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G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

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Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

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