Name: g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00
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Este trabajo fue financiado por beca NIH GM117446 a A.B.

1. preparación de células de flujo Cytometry clasificación
<ol><li>Inocular tubos de ensayo de 15 mL que contiene 8 mL de caldo YEPD tal que los cultivos alcanzan una densidad de 5 x 106 a 1.5 x 107 células por mL después de crecimiento durante la noche (véase la discusión Nota 1).</li>
	<li>Desactivación de las células de levadura (1.400 x g, a temperatura ambiente o 4 ° C) en un tubo de centrífuga de 15 mL tapón durante 5 min, resuspender las células en etanol al de 70% 1.5 mL y tra...

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

Mientras que esta técnica es robusta y relativamente directo, una atención especial debería destinarse a los siguientes:
(1) recomendamos que las culturas crecen durante al menos 12 h antes de llegar a la fase de registro, ya que las diferencias se manifiestan en ciclo celular distribuciones si las culturas son cosechadas después de haber alcanzado la densidad deseada a 4 h después de la inoculación. Nuestra hipótesis es que una distribución de ciclo celular que ha alcanzado un equilib...

Replicación del genoma eucariota se inicia en múltiples sitios discretos, llamados origen de replicación, de que la replicación horquillas proceden en ambas direcciones (revisados en Fragkos et al., 20151). Orígenes varían en su tiempo y eficiencia de la cocción, y se han desarrollado varias técnicas para supervisar la actividad de origen de replicación y aclarar las causas de esta variación. De niveles de single-stranded DNA2, que se forma alrededor de origen activo, puede inferirse la actividad de orígenes individuales o mediante el uso de electroforesis en 2D para supervisar la replicación específica intermedios3, que pueden ser detectadas con sondas radiactivas. Ambas de estas técnicas se aplican más fácilmente en S. cerevisiae que en células de mamífero, porque orígenes se limitan a secuencias específicas conocidas en la antigua. Con el advenimiento de los microarrays, llegó a ser posible evaluar origen disparando a nivel mundial. Esto fue hecho primero por etiquetado ADN con isótopos pesados, liberación de las células de un bloque de G1 en medio que contiene isótopos ligeros y monitoreo luego de la formación de pesados ligeros híbridos ADN en el genoma4. La introducción de secuenciación de alto rendimiento permitido genoma similares monitoreo de la actividad de origen sin el requisito de etiquetado isotópico caro. Las células fueron clasificadas en un citómetro de flujo según el contenido de ADN y su ADN sometido a secuenciación profunda. Porque la cobertura de secuencia procede de 1 x a 2 x en el transcurso de la fase S, sincronización de replicación relativa puede evaluarse comparando profundidades lecturas de células en fase S que en G1 o G25,6. Estas técnicas, aplicadas particularmente a levadura, condujeron a una comprensión más profunda de cómo proteínas de replicación de ADN, secuencia de la DNA y estructura de la cromatina regulan eficiencia y tiempo de origen.
La transmisión fiel de la información genética durante la proliferación celular requiere no sólo exitosa iniciación de la replicación del ADN, que ocurre en el origen, pero también superación de replicación, que ocurre el encuentro de las horquillas de replicación. Como iniciación de la replicación, el momento de la terminación de la replicación varía a lo largo del genoma con ciertas regiones restantes sin replicar hasta tarde en el ciclo celular. Tales regiones pueden ser particularmente distantes de orígenes de replicación activa o pueden contener secuencias o estructuras de cromatina que impiden polimerasas de la DNA. Tarde replicar las regiones puede manifestarse como sitios frágiles, que se asocian a fractura cromosómica y mayores tasas de mutación y se han implicado en cáncer y envejecimiento7,8,9. Sin embargo, a pesar de la importancia de la correcta terminación de la replicación del ADN en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, nuestra comprensión de dónde y cómo esto ocurre ha retrasado lejos detrás de la iniciación de la replicación. Y mientras que los genes individuales cuya replicación tardía se ha asociado con la enfermedad han sido estudiados con, por ejemplo, qPCR10, globales estudios dirigidos a dilucidar las localizaciones y causas de la última replicación han faltado subyacentes. Aquí describimos una técnica que nos referimos a como "G2 seq" en el que combinamos la citometría de flujo con secuenciación de alto rendimiento para arrojar luz sobre la terminación de la replicación del genoma de la levadura11. Con pequeñas modificaciones, este protocolo puede ser adaptado a cualquier célula que puede ser flujo y ordenada según el contenido de ADN.

<table width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">YeaStar Genomic DNA kit</td>
			<td style="width:135px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-323</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">1 &#181;M SYTOX Green</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">57020</td>
			<td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="width:301px;height:147px;">RNase solution (0.25 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R6513</td>
			<td style="width:167px;">0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:301px;height:42px;">proteinase K solution (20 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher / Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-015</td>
			<td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Model 50 Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>FB50A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">BD Biosciences FACSAria II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Zymo-spin III columns</td>
			<td style="width:135px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td>
			<td style="width:135px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">500219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>15026486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina HiSeq 2500 instrument</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>SY&#8211;401&#8211;2501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:301px;height:63px;">gsnap alignment software</td>
			<td style="width:135px;">open source software / Genentech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://research-pub.gene.com/gmap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

Numerosas técnicas se han desarrollado para seguir el progreso de la replicación del ADN a través de la fase S del ciclo celular. La mayoría de estas técnicas se han dirigido hacia la aclaración de la ubicación y el momento de inicio de la duplicación del genoma en lugar de su realización. Sin embargo, es fundamental que entendemos regiones del genoma que son última completar la replicación, porque estas regiones sufren niveles elevados de rotura cromosómica y mutación, y han sido asociados con la enfermedad y el envejecimiento. Aquí describimos cómo hemos ampliado una técnica que se ha utilizado para vigilar la iniciación de la replicación en cambio identificar las regiones del genoma última replicación completa. Este enfoque se basa en una combinación de citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento. Aunque este informe se centra en la aplicación de esta técnica a la levadura, el enfoque puede utilizarse con cualquier célula que se puede ordenar en un citómetro de flujo según el contenido de ADN.

Hemos utilizado el procedimiento descrito anteriormente para identificar sitios de replicación tardíos en levadura de florecimiento. Prueba este planteamiento con una región de replicación finales conocida en un cromosoma artificial demostró la técnica exacta y fiable. Nuestros resultados también han demostrado la importancia biológica de la oportuna terminación de la replicación, mostrando que una región replicación tardía en el cromosoma 7, que identificamos como replicaci?...

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G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

Describimos una técnica para combinar la citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento para identificar regiones finales replicación del genoma.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

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Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

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