Name: g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome at JoVE.com

Detta arbete stöds av grant NIH GM117446 till A.B.

1. beredning av celler för Flow flödescytometri sortering
<ol><li>Inokulera 15 mL provrör innehållande 8 mL varje YEPD buljong sådana att kulturerna nå en densitet på 5 x 106 till 1,5 x 107 celler per mL efter övernattning tillväxt (se diskussion not 1).</li>
	<li>Snurra ner jästceller (1 400 x g, vid rumstemperatur eller 4 ° C) i ett 15 mL skruvlock centrifugrör för 5 min, Omsuspendera cellerna i 1,5 mL 70% etanol och överföring till ett 1,6 mL mikrofugrör, låta detta sit för 1 ...

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

Medan den här tekniken är robust och relativt rakt framåt, särskild uppmärksamhet bör ägnas följande:
(1) Vi rekommenderar att kulturer växa för minst 12 h innan de når log fas, eftersom skillnader manifesteras i cellcykeln distributioner om kulturer skördas efter att ha uppnått önskad täthet bara 4 h efter inympningen. Vårt antagande är att en cellcykeln-distribution som har nått en relativt stabil equilibrium bättre representerar en ”riktig” log fas fördelning än en ...

Eukaryota genomet replikering initieras på flera diskreta platser, kallas beskärningarna av replikering, från vilka replikering gafflar fortsätter i båda riktningarna (ses i Fragkos et al., 2015-1). Ursprung varierar i både deras timing och effektivitet av bränning, och flera tekniker har utvecklats för att övervaka replikering ursprung aktivitet och klarlägga orsakerna till denna variation. Aktiviteten av enskilda ursprung kan härledas från nivåer av enkelsträngat DNA2, som utgör runt aktiva ursprung, eller genom att använda 2D gelelektrofores för att övervaka specifika replikering intermediärer3, vilka båda kan upptäckas med radioaktiva sonder. Båda dessa tekniker tillämpas lättare i S. cerevisiae än i däggdjursceller, eftersom ursprung är begränsade till specifika kända sekvenser i fd. Med tillkomsten av microarrays blev det möjligt att bedöma ursprung bränning globalt. Detta gjordes först av märkning DNA med tunga isotoper, släppa celler från en G1-blocket i medium innehållande lätta isotoper och sedan övervaka bildandet av tunga-lätta hybrid DNA över genomet4. Införandet av hög genomströmning sekvensering tillät liknande genome-wide kontroll av ursprung aktivitet utan krav på dyra isotopiska märkning. Cellerna var sorterade i en flödescytometer enligt DNA-innehåll och deras DNA som utsätts för djupsekvensering. Eftersom sekvensen täckning intäkter från 1 x till 2 x under loppet av S fas, kan relativa replikering timing bedömas genom att jämföra Läs djupet av celler i S-fas till dem i G1 eller G25,6. Dessa tekniker, särskilt tillämpas på jäst, ledde till en djupare förståelse för hur DNA-sekvens, kromatinstruktur och DNA-replikering proteiner reglerar ursprung timing och effektivitet.
Trogen överföring av genetisk information under cellulär proliferation kräver inte bara framgångsrika inledandet av DNA-replikation, som äger rum på ursprung, men också framgångsrikt slutförande av replikering, vilket inträffar där replikering gafflar möts. Som inledande replikering varierar tidpunkten för slutförande av replikering i genomet med vissa regioner återstående unreplicated även sent i cellcykeln. Sådana områden kan vara särskilt långt från aktiv replikering ursprung eller kan innehålla sekvenser eller kromatin strukturer som hämmar DNA-polymerases. Sent replikera regioner kan manifestera sig som sårbara platser, som är associerade med kromosomala brott och högre mutation priser, och har varit inblandade i cancer och åldrande7,8,9. Men trots vikten av korrekt slutförande av DNA-replikation i underhåll av genomet stabilitet, har vår förståelse av var och hur detta sker halkat långt efter replikering insättande. Och medan enskilda gener vars slutet replikering har associerats med sjukdomen har studerats med, till exempel qPCR10, globala studier inriktas på att klarlägga platserna och bakomliggande orsaker sen replikering har saknats. Här beskriver vi en teknik som vi refererar till som ”G2 seq” där vi kombinerar flödescytometri med hög genomströmning sekvensering att belysa slutförandet av genomet replikering i jäst11. Med smärre förändringar, kan detta protokoll anpassas till alla celler som kan vara flöde-sorterad enligt DNA-innehåll.

<table width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">YeaStar Genomic DNA kit</td>
			<td style="width:135px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-323</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">1 &#181;M SYTOX Green</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">57020</td>
			<td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">50 mM sodium citrate, pH 7.2</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="width:301px;height:147px;">RNase solution (0.25 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R6513</td>
			<td style="width:167px;">0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:301px;height:42px;">proteinase K solution (20 mg / mL)</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher / Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-015</td>
			<td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Model 50 Sonic Dismembrator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>FB50A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">BD Biosciences FACSAria II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Zymo-spin III columns</td>
			<td style="width:135px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">C1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td style="width:135px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td>
			<td style="width:135px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">500219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>15026486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:301px;height:21px;">Illumina HiSeq 2500 instrument</td>
			<td style="width:135px;">Illumina</td>
			<td>SY&#8211;401&#8211;2501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:301px;height:63px;">gsnap alignment software</td>
			<td style="width:135px;">open source software / Genentech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://research-pub.gene.com/gmap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

Många tekniker har utvecklats för att följa utvecklingen av DNA-replikation genom den S fasen i cellcykeln. De flesta av dessa tekniker har varit riktad mot förtydligandet av platsen och tidpunkten för inledandet av genomet dubbelarbete i stället för dess slutförande. Det är dock viktigt att vi förstår regioner i genomet som är sist att slutföra replikeringen, eftersom dessa regioner drabbas av förhöjda nivåer av kromosomala brott och mutation, och de har förknippats med både sjukdom och åldrande. Här beskriver vi hur vi har förlängt en teknik som har använts för att övervaka replikering initiering för att istället identifiera de regionerna i genomet senast för fullständig replikering. Denna strategi är baserad på en kombination av flödescytometri och hög genomströmning sekvensering. Även om detta betänkande fokuserar på tillämpningen av denna teknik på jäst, kan metoden användas med celler som kan sorteras i en flödescytometer enligt DNA-innehåll.

Vi har använt proceduren ovan för att identifiera sena replikerande platser i spirande jäst. Testa detta synsätt med en känd sen replikerande region på en konstgjord kromosom visade tekniken att vara riktig och tillförlitlig. Våra resultat har även visat den biologiska betydelsen av tid slutförandet av replikering av visar att en sena replikerande region på kromosom 7, som vi identifierat som sena replikera på grundval av våra G2-seq resultat, var förlorat cirka trefaldigt o...

Watch this Scientific Journal Video about G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome at JoVE.com

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En hög genomströmning sekvensering-baserad teknik för att identifiera sent replikera regioner i genomet

Vi beskriver en teknik för att kombinera flödescytometri och hög genomströmning sekvensering att identifiera sena replikerande regioner i genomet.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

En Robotic plattform för hög kapacitet Protoplast Isolering och Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Kartläggning av MLV-integrationswebbplatser för att definiera cellspecifika reglerande regioner

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Mikroskop och Transplantation teknik för Nasonia vitripennis genomet Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Hög genomströmning identifiering av synergistisk läkemedelskombinationer med överlappning2 Metod

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Arrangören Capture-C: Högupplösta, Genome-wide profilering av promotorn interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika Set-metoden: En hög genomströmning strategi att kvantitativt mäta Caenorhabditis elegans livslängd

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...