Name: live imaging followed by single cell tracking to monitor cell biology and the lineage progression of multiple neural populations
Uploaded: 2017-12-16T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations at JoVE.com

ونحن نشكر جاسكون بياتريس لعملها المساعدة والفن في الشكل 1. كما نشكر الدكتور جيم نوريس لمساعدته. الأعمال المعروضة هنا أيد منح البحوث، "اكسسيلينسيا دي الأحمر مبادرة تدعيم إنجينيو الإسبانية أيون قناة" (BFU2015-70067REDC)، وزارة التعليم والعلوم (BFU2014-53654-P) وبرادي-سم (S2013/الجليد-2958)، UCM-سانتاندر (PR26/16-18 باء-3) ومؤسسة رامون برنامج منح أريسيس (PR2018/16-02). فيليبي اورتيجا تسلم y رامون كاجال برنامج وزارة الاقتصاد الإسبانية والقدرة التنافسية (MEC: تأهيل-2013-13290).

<ol>
	<li>Conklin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mutation+Theory+From+the+Standpoint+of+Cytology.">The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology.</a> Science. 21 (536), 525-529 (1905).</li><li>Ortega, F., Costa, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Rodents.">Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents.</a> Front Neurosci. 10, 78 (2016).</li><li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics.">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+hematopoiesis+at+the+single+cell+level.">Tracking hematopoiesis at the single cell level.</a> Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).</li><li>Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-cell+approaches+to+stem+cell+research.">Quantitative single-cell approaches to stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).</li><li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrogliogenic+and+neurogenic+adult+subependymal+zone+neural+stem+cells+constitute+distinct+lineages+and+exhibit+differential+responsiveness+to+Wnt+signalling.">Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).</li><li>Costa, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+division+and+lineage+progression+in+vitro.">Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro.</a> Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Successful+Negotiation+of+a+Metabolic+Checkpoint+in+Direct+Neuronal+Reprogramming.">Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells.">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).</li><li>Kleiderman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Nonproliferating+Astrocytes+into+Neurogenic+Neural+Stem+Cells:+Control+by+FGF2+and+Interferon-gamma.">Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma.</a> Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).</li><li>Bunk, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+Is+Required+for+Oligodendrocyte+Cell+Identity+in+Adult+Neural+Stem+Cells+of+the+Subventricular+Zone.">Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone.</a> Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).</li><li>Aravantinou-Fatorou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEND1+and+NEUROGENIN2+Reprogram+Mouse+Astrocytes+and+Embryonic+Fibroblasts+to+Induced+Neural+Precursors+and+Differentiated+Neurons.">CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).</li><li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level.">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Jimenez, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiation+of+ATP+calcium+responses+by+A2B+receptor+stimulation+and+other+signals+coupled+to+Gs+proteins+in+type-1+cerebellar+astrocytes.">Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes.</a> Glia. 26 (2), 119-128 (1999).</li><li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties.">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).</li><li>Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny.</a> Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrogliosis+in+culture:+I.+The+model+and+the+effect+of+antisense+oligonucleotides+on+glial+fibrillary+acidic+protein+synthesis.">Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis.</a> J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

واحدة من أهم القيم من تصوير مباشر هو إمكانية القيام بتتبع نسب دقيقة، توضيح الجوانب الحرجة لتطور النسب في عدد سكان العصبية. يعرف بأنه تحديد النسب تعقب ورصد جميع ذرية من السلف مفردة، من مؤسس الاستنساخ لاستنساخ اللاحقة شكلت21. بشكل ملحوظ، الطرق البديلة المستخدمة للنسب التتبع (مثلاً، وتوصيل الفيروسية أو مراسل متعدد الألوان بنيات21) قد عيب حرجة، حيث يستند النتيجة النهائية ما زالت الصور وأنه لا بالضرورة وتشكل سلسلة كاملة. وهذا يعني أن موت الخلية، التباين في سلوك السكان الخلية، وتمييع، كفاءة نشر أو الفقيرة من العلامات، جنبا إلى جنب مع عوائق هامة أخرى، يؤدي إلى read-outs غير مكتملة أو غير صحيحة ل نتائج2. وعلاوة على ذلك، يتيح تصوير يعيش الباحث لتحليل السمات الهامة لبيولوجيا العصبية من السكان، مثل أسلوب وتوقيت انقسام الخلايا ونمو الخلايا، والهجرة وانتشار مقابل التمايز، ومدة دورة الخلية، نيوريتي تشكيل والتعقيد والطول، خلية تحديد مصير (التمايز)، أو التحويل (إعادة برمجة).
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تستكمل تصوير مباشر بسهولة مع التحليلات الأخرى تهدف إلى الحصول على بيانات من خلايا مفردة مثل، على سبيل المثال، تسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، تحقيق الفائدة المشتركة من التصوير الحي وغيرها من التقنيات تتطلب تلك الخلايا التي سبق رصدها في الأفلام في وقت لاحق إعادة تحديد والتي جمعت على حدة للتحليل الثانوي. يمكن تحقيق ذلك باستخدام المجاهر التي تتضمن الإحداثيات الموضعية، بتطبيق الصحفيين الفلورسنت لخلايا معينة أو بتحليل توزيع مجموعات من الخلايا كمراجع. في الواقع، المزيج من التشكيل الجانبي الترنسكربيتوم وسلوك الخلايا الفردية قد تمثل طريقا قوية توضيح الرموز الجزيئية الجديدة تشارك في بيولوجيا الخلايا.
واحدة من المشاكل الرئيسية التي يمكن أن تنال من تجربة تصوير الحي بكثافة ثقافة خلية غير كافية. كما ذكر سابقا، في كثافة عالية الفائض من الحطام أو الانفصال الفقراء (تشكيل أجمة) قد تؤثر على نوعية والقرار المكانية للصور، مما يجعل تعقب خلية مفردة غير مجد. ولذلك، ينبغي تعديل ظروف السكان خلية متميزة تحت الدراسة بأقل عدد من الخلايا ممكن دون المساس باستمرارية ثقافة الخلية.
تكرار الحصول على الصور هي أيضا حاسمة وينبغي تعديلها بعناية، خاصة عندما يتم استخدام الإضاءة الفلورية. الإفراط في التعرض لإرسالها، ولا سيما الأسفار الضوء قد يعرض للخطر بقاء الخلية. بدلاً من ذلك، قد تتداخل تأخير زائد بين التقاط الصور مع القرار الزمني للتحليل.
خطوة حاسمة أخرى خلال التجربة الحية بالتصوير هو التعديل الدوري للتركيز. فشل في تصحيح الإعداد/إعادة-ستينغ من البعد البؤري قد يعيق تعقب خلية مفردة. وعلاوة على ذلك، من الضروري أن تحقق بعناية أن غرفة الحضانة يحافظ على درجة الحرارة المناسبة، والرطوبة، ومستويات2 CO، تعديل التغيرات غير المرغوب فيها التي قد تسبب موت الخلايا.
أخيرا، متى تم أداؤه مبادئ العقود التجارية الدولية، من المهم لاسترداد موضع xyz صفر قبل الجولة الأخيرة من الحصول على الصور بشكل صحيح. غير صحيحة إعادة تحديد xyz موضع صفر سوف تجعل من الصعب على تطابق الصور والمرحلة-على النقيض من الفلورة، إعاقة تحديد النسل الخلية.
على الرغم من أن هذا النهج له جوانب إيجابية كثيرة، ما زالت هناك بعض القيود لتصوير يعيش السكان العصبية. على سبيل المثال، الخلية منخفضة الكثافة المطلوبة للقيام بتعقب خلية واحدة ناجحة من أنسكس يجعل من المستحيل على توظيف فحوصات الكيمياء الحيوية، مثل الغربية النشاف14. بالإضافة إلى ذلك، رصد سريع تقسيم السكان مثل astrocytes الدماغ أو خلايا N2a مقيد وقتيا، غالباً ما يصعب جداً لتعقب الخلايا بالقرب من التقاء الثقافات. علاوة على ذلك، العديد من أساليب الثقافة، فضلا عن القيود المتأصلة البيولوجية المرتبطة بعزل الخلايا، غالباً ما يعرض للخطر بقاء الخلية على مدى فترات طويلة، تحد مدة تجارب التصوير الحي. وأخيراً، عزل الخلايا من بيئتها الطبيعية قد آثار إيجابية وسلبية على حد سواء. قد تفشل الخلايا المعزولة من مكانها الفسيولوجية لتلقي الإشارات الهامة التي تعدل سلوكها، في الوقت نفسه، فإنه يمثل وسيلة قوية اختبار تأثير تلك الإشارات على حدة في تطور النسب الخاصة بالعصبية والسكان.
ونظرا للقيود المذكورة أعلاه، فمن الواضح أن السيناريو منهجية مثالية القيام بتجارب تتبع الخلية التصوير وواحد يعيش تحت ظروف فيزيولوجية طبيعية في فيفو. التقنيات الحالية غير قادر على متابعة الخلايا المفردة لفترات طويلة من الزمن في المناطق العميقة من الدماغ2. ولذلك، ينبغي أن تركز مستقبل التصوير الحي على التغلب على هذا التحديد، تهدف إلى تحليل الكامل بيولوجيا الخلية من الخلايا المفردة في فيفو مع احتمال التدخل الأكثر بسيطة من البيئة الفسيولوجية3.

من أجل تطوير استراتيجيات علاجية جديدة وأكثر فعالية لتجديد السكان العصبية، يجب علينا أولاً أن نفهم الآليات الأساسية التي تحافظ على خلايا مع احتمال العصبية التجدد. السعي إلى تحقيق هذا الهدف يتطلب معرفة شاملة بالعوامل التي تنظم التوازن بين التتابع وانتشار/التمايز، ووضع وتوقيت لشعبة، طول دورة الخلية، القدرات المهاجرة، والجدوى، إلخ. على الرغم من اتباع نهج تقنية التي استخدمت للعديد من السنوات1، يعيش التصوير والمراقبة المباشرة لا تزال أفضل خيار لرصد الأحداث المذكورة أعلاه. خلافا للعديد من النهج الأخرى التي تركز على قراءات نقطة النهاية، يعيش التصوير وخلية واحدة تتبع معلومات طوال مدة التجربة2،3،،من45، 6-وهكذا، يتيح إضافة الأزمنة موت الخلية أو سلوك الخلية غير متجانسة أو خلية مصير القرارات، فضلا عن العديد من الآخرين الأحداث الهامة اسمه أن خلاف ذلك قد يمر دون أن يلاحظها أحد. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن ترصد هذه الميزات من الخلايا أفضل في خلية مفردة مستوى المجراة، حيث كلا الجوهرية (خلية المتمتعة بالحكم الذاتي) والخارجية العظة (الخلية المتخصصة) تؤخذ في الاعتبار.
ومع ذلك، على الرغم من أن في في المختبر أحداث حالة تحدث في بيئة لا تتكاثر على الوسط الطبيعي، الشروط الثقافة المنخفضة الكثافة المستخدمة عادة في هذه البروتوكولات أكثر مناسبة للكشف عن الخصائص الجوهرية الخلايا. وعلاوة على ذلك، عنصر تحكم مبسطة أكثر من الوسط المحيطة به، ببساطة تعديل المتوسطة النمو، قد تشكل أداة قيمة للتحقيق في دور فردية لكل عامل خارجية أن يعرف مكانة العصبية، فضلا عن العوامل البيئية التي قد أن يتسبب في الحالات المرضية7،8،9،10،11،،من1213. ولذلك، عند تكوينه بشكل صحيح، كما هو الحال في البروتوكول المقترح هنا، تصوير مباشر يوفر حلاً عمليا في المختبر لمعالجة معظم المسائل المذكورة سابقا.
وباختصار، يصف هذا البروتوكول الأجهزة والبرمجيات، وشروط الثقافة والخطوات الرئيسية المطلوبة لنجاح إجراء تجربة تصوير الحي متبوعاً بخلية واحدة فقط تتبع. ويوفر هذا النهج قيمة المعلومات التي تساعد على الكشف عن الجوانب الأساسية لعلم الأحياء وتطور النسب، السكان العصبية متعددة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899</td>
			<td>Working solution 0.02 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 wells plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11869</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#946; III Tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP</td>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945; Tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse FITC</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-2000-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ref 280MRH10101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ref 280MRH48230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pE-300 LED fluorescence</td>
			<td>Cool LED</td>
			<td>Ref Number 1981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>310M-201 Incubation system (temperature)</td>
			<td>OKO-Lab</td>
			<td>Serial N&#186; VOF007307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-ScanII&#160; Motorized stage system</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Serial N&#186; 60018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High precision microscope camera version 4.2</td>
			<td>ANDOR Zyla</td>
			<td>VSC-03650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OKO touch Incubation system (CO2)</td>
			<td>OKO-lab</td>
			<td>Serial number 1716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCCCCL131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging followed by single cell tracking to monitor cell biology and the lineage progression of multiple neural populations

فهم الآليات التي تتحكم في الأحداث البيولوجية الحرجة من السكان الخلايا العصبية، مثل انتشار أو التفريق أو خلية مصير القرارات، سوف تكون حاسمة بالنسبة لتصميم الاستراتيجيات العلاجية للعديد من الأمراض التي تصيب الجهاز العصبي. الأساليب الحالية لتعقب خلية السكان يعتمدون على نتائجها النهائية في الصور الثابتة وعموما فشلوا في تقديم القرار الزمنية الكافية لتحديد السمات السلوكية في الخلايا المفردة. وعلاوة على ذلك، الاختلافات في موت الخلية، تغاير السلوكية داخل سكان خلية، وتمييع، نشر، أو انخفاض كفاءة العلامات المستخدمة لتحليل الخلايا هي جميع العوائق الهامة التي سوف تؤدي إلى read-outs غير مكتملة أو غير صحيحة من النتائج. على العكس من ذلك، إجراء تصوير مباشر ووحيد الخلية تتبع ظروف ملائمة يمثل أداة قوية لرصد كل من هذه الأحداث. هنا، يتم وصف بروتوكول الوقت الفاصل بين الفحص المجهري الفيديو، تليها مرحلة ما بعد المعالجة، لتعقب السكان العصبية مع القرار خلية مفردة، باستخدام برامج معينة. الأساليب الموصوفة تمكن الباحثين من معالجة المسائل الأساسية المتعلقة بتطور علم الأحياء والنسب خلية السكان العصبية متميزة.

تمكن الطريقة الموضحة الأسئلة الحرجة المتعلقة ببيولوجيا الخلية السكان العصبية متعددة يتعين حلها. على سبيل المثال، كان من الممكن رصد تطور نسب العصبية وأوليجوديندروجليوجينيك أنسكس،من78،،من1418. عن طريق تتبع أنسكس واحدة وذرياتهم (الشكل 2 أ، ب)، كان من الممكن إثبات أن أنسكس معزولة في المختبر الحفاظ على طابعها العصبية، معظمها توليد نيوروبلاستس، وأنها تتبع تسلسل اقترح في فيفو19 ولكن لم تكن برهنت على مستوى الخلية الواحدة. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا النظام ثقافة الشعب خلية غير متماثل تصور لأول مرة في النسب aNSC من المناطق الاقتصادية الخاصة (الشكل 2)، تقدم نموذجا فريداً لدراسة الأمن القومي الذاتي تجديد8،14. وبالمثل، وبصرف النظر عن النسب تم تحليلها، كان من الممكن الحصول على بيانات قيمة فيما يتعلق بنمو الخلايا، والجولات لشعبة، وبقاء الخلية، أو طول دورة الخلية.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig2.jpg"> 
الشكل 2- مثال أنسكس معزولة عن المناطق الاقتصادية الخاصة، وتحليلها بواسطة التصوير الحي وخلية واحدة تتبع. صور التباين المرحلة تصور تقدم الاستنساخ في نقاط زمنية مختلفة (دقيقة اليوم-h:). الصورة النهائية ويناظر إيمونوسيتوتشيميستري بعد انتهاء تصوير (مبادئ العقود التجارية الدولية) الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني، الأحمر)، βIII-tubulin (أخضر) و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، الأزرق). (أ) تحليل متماثل الأشجار العصبية من خلال جولات مختلفة من تضخيم الانقسامات لتوليد neuroblasts الانقسامية بعد. الأسهم الحمراء تشير إلى الخلايا المدرجة في الأشجار متماثل. على اليمين، يتم عرض أشجار النسب المقابلة لاستنساخ والتي تم إنشاؤها بواسطة برنامج tTt. (ب) مثال للسلف توليد شجرة العصبية غير متماثلة، مع فرع واحد يمر الشعب زيادة لإنتاج neuroblasts بينما تثير الأخرى هادئة توصيني الخلايا إيجابية من خلال حدث الذاتي تجديد محتملة. على اليمين، يتم عرض شجرة النسب التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج tTt. في جميع أشجار النسب: "N" يصور neuroblasts الانقسامية اللاحقة؛ "G"، هادئة توصيني-إيجابية الخلايا؛ "X"، موت الخلية؛ و "؟" خلية المفقودة. يمثل الشريط مقياس 50 ميكرومتر. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
يعيش التصوير وخلية واحدة تتبع التحليل أيضا ينص قراءات دقيقة القدرات المهاجرة للسكان العصبية. تم الحصول على هذه المعلومات من أستروسيتيس الدماغ بعد الولادة المقدمة لجرح الصفر مقايسة20، توليد المعلومات فيما يتعلق بمتوسط المسافة سافر من قبل أستروسيتيس عند إغلاق الجرح (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، كان من الممكن أن نرى بعض من أستروسيتيس تقسيم أثناء عملية الشفاء، بينما البعض الآخر تتغير طوال التجربة. لافت للنظر، تلك التي قسمت يبدو يحمل سلوك المهاجرة غزير أكثر من نظرائهم من غير تقسيم (السفر مرتين والآن في المتوسط). وتقترح هذه الظاهرة عدم تجانس مثيرة جداً لاهتمام في قدرة أستروسيتيس لتشكيل ندبة على الضرر الذي تم تخفيفه إلى في القراءة لتجربة تحليل نقطة النهاية الكلاسيكية.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig3.jpg"> 
الشكل 3- تحليل سلوك المهاجرة astrocytes الدماغ بعد الولادة في الصفر الجرح المقايسة. مرحلة التباين الصور تصوير الجرح في نقاط زمنية مختلفة (دقيقة اليوم-h:). أشجار النسب، التي تم إنشاؤها بواسطة tTt البرمجيات، توضيح السلوك الممثل، من حيث تقسيم الخلية، أستروسيتيس أثناء إغلاق الجرح. ويبين الرسم البياني متوسط المسافة سافر من قبل astrocytes تحليلها بواسطة خلية واحدة تتبع (يعني ± S.E.M.). يمثل الشريط مقياس 50 ميكرومتر. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
ميزة أخرى للاهتمام الوقت الفاصل بين تجارب الفيديو-الفحص المجهري هو القدرة على مقارنة الانتشار والتفرقة بين سكان خلية. نحن اختبار خلايا N2a مطلي في ظل الظروف التي تشجع على انتشار (بحضور 10% مصل بقرى الجنين (FBS)) أو التفريق (حضور 0.5% FBS + حمض اراسيدونيك 10 ميكرومتر). كان من الممكن لمتابعة تطور نسب هذه الخلايا تحت ظروف التكاثري (الشكل 4A)، بينما لا تتكاثر خلايا مميزة، وأنها تشكل نيوريتيس (الشكل 4 باء). بشكل ملحوظ، يسمح وحيد الخلية تتبع المستعمرات مع مختلف انتشار القدرات أن تكون متميزة واستطالة نيوريتي (وتراجع) تقييمها، توفير بيانات دقيقة والكمية التي يمكن تصديرها في وقت لاحق.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig4.jpg"> 
الشكل 4- رصد N2a بيولوجيا الخلية في انتشار (A) أو التمييز بين الشروط (ب). مرحلة التباين الصور تصور تقدم الاستنساخ في نقاط زمنية مختلفة (دقيقة اليوم-h:). يتوافق مع الصورة النهائية لتصوير ما بعد إيمونوسيتوتشيميستري (مبادئ العقود التجارية الدولية) ل α-tubulin (أخضر). خلية مفردة (أ) تتبع يسمح بجولات للشعبة التي يتعين رصدها، فضلا عن عدم تجانس في الاستجابة التكاثري من خلايا مختلفة. على اليمين، يوضح شجرة النسب التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج tTt السلوك التكاثري N2a الخلايا. إنهاء دورة الخلية خلايا (ب) ظروف التمايز وتوليد نيوريتيس، عملية التي يمكن أن تقاس فعالية بتحليل ما بعد التصوير. واحدة تتبع الخلية، ممثلة بشجرة النسب على الحق، ويوضح كيف الخلايا N2a إنهاء دورة الخلية ووقف انقسام الخلايا تحت ظروف التمايز. يمثل الشريط مقياس 50 ميكرومتر.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
أخيرا، تعيش التصوير وخلية واحدة تتبع مفيد للغاية لرصد التغيرات المورفولوجية والجزيئية عندما تقدم إلى إعادة برمجة الخلايا. تصوير مباشر من بعد الولادة أستروسيتيس ترانسدوسيد مع هومولوج أشعت-ترس 1 (Ascl1) يوفر بيانات قيمة فيما يتعلق بالتغييرات الشكلية التي تحدث أثناء إعادة برمجة أو الانسداد لانقسام الخلية عندما يجري astrocytes أعيدت برمجتها (انظر الشكل 5). وعلاوة على ذلك، عند توصيل Ascl1 يقترن بتوصيل بنية الترميز للبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) تحت سيطرة المروج كورتن مزدوجة (DCX)، من الممكن تحديد النقطة الزمنية الدقيقة عند العصبية علامات محددة يبدأ بالتعبير عنها في الخلايا أعيدت برمجتها (الشكل 5). كما يسمح مجهرية الفيديو الوقت الفاصل بين عدد الخلايا التي تكمل بنجاح إعادة برمجة ليكون كمياً ومقارنة بالخلايا التي تموت أثناء هذه العملية. رصد مثل هذه الأحداث أدت إلى تحديد حاسم "نقاط التفتيش" في الخلايا التي أعيدت برمجتها بنجاح9.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig5.jpg"> 
الشكل 5- تحليل astrocytes القشرية بعد الولادة يتعرض لإعادة برمجة الخلايا العصبية. إعادة برمجة حملت بتوصيل مع نواقل البروتين (RFP) Fluorescence الأحمر Ascl1 برو--العصبية. تم تحويل الخلايا العصبية تحت إشراف توصيل المشارك مع ناقل ترميز بروتينات فلورية خضراء تحت سيطرة أحد المروجين DCX. تظهر الصور التباين مرحلة التقدم لإعادة برمجة في نقاط زمنية مختلفة (دقيقة اليوم-h:). صور fluorescence التعبير طلبات تقديم العروض والتجارة والنقل، على التوالي. يعيش التصوير ويسمح وحيد الخلية تتبع الأحداث الحاسمة الواجب اتباعها، مثل التغييرات الشكلية، عدم وجود انقسام الخلايا أثناء إعادة برمجة، موت الخلية، ويمكن تعريفها بدقة الوقت عندما تبدأ الخلايا أعيدت برمجتها للتعبير عن علامات العصبية . يمثل الشريط مقياس 80 ميكرومتر. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations at JoVE.com

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

يعيش تصوير متبوعاً بخلية واحدة تتبع لرصد خلية علم الأحياء وتطور نسب السكان العصبية متعددة

ويرد وصف بروتوكول قوية لمراقبة السكان العصبية بالفيديو-الفحص المجهري الوقت الفاصل بين تليها مرحلة ما بعد المعالجة المستندة إلى البرامج. ويمثل هذا الأسلوب أداة قوية لتحديد الأحداث البيولوجية في عدد سكان محدد أثناء تجارب التصوير الحي.

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

تحليل للهجرة كريست العصبية والتمايز بواسطة الصليب الأنواع زرع

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

بصري تسجيل النشاط العصبي للقرار suprathreshold وحيدة الخلية واحد مسمار-

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

عزل وزراعة المتكفل العصبية تليها الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن من هستون 3 يسين 79 مارك ديميثيليشن

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...