Name: live imaging followed by single cell tracking to monitor cell biology and the lineage progression of multiple neural populations
Uploaded: 2017-12-16T14:00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations at JoVE.com

Мы благодарим Beatriz гасконец за ее помощь и искусства работы на рисунке 1. Мы также благодарим д-р C. Норрис за его помощь. Работы, представленные здесь была поддержана исследовательских грантов, «красный де Джубая Consolider-Инхенио испанский ионного канала инициатива» (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), БРАД-CM (S2013/ICE-2958), UCM-Сантандер (PR26/16-18В-3) и Фонд Рамон Программа грантов Аресес (PR2018/16-02). Фелипе Ortega признает Ramon y Cajal программа испанского министерства экономики и конкурентоспособности (MEC: Исправительные-2013-13290).

<ol>
	<li>Conklin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mutation+Theory+From+the+Standpoint+of+Cytology.">The Mutation Theory From the Standpoint of Cytology.</a> Science. 21 (536), 525-529 (1905).</li><li>Ortega, F., Costa, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Rodents.">Live Imaging of Adult Neural Stem Cells in Rodents.</a> Front Neurosci. 10, 78 (2016).</li><li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics.">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+hematopoiesis+at+the+single+cell+level.">Tracking hematopoiesis at the single cell level.</a> Ann N Y Acad Sci. 1044, 201-209 (2005).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).</li><li>Etzrodt, M., Endele, M., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-cell+approaches+to+stem+cell+research.">Quantitative single-cell approaches to stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 15 (5), 546-558 (2014).</li><li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrogliogenic+and+neurogenic+adult+subependymal+zone+neural+stem+cells+constitute+distinct+lineages+and+exhibit+differential+responsiveness+to+Wnt+signalling.">Oligodendrogliogenic and neurogenic adult subependymal zone neural stem cells constitute distinct lineages and exhibit differential responsiveness to Wnt signalling.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 602-613 (2013).</li><li>Costa, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+division+and+lineage+progression+in+vitro.">Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro.</a> Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).</li><li>Gascon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Successful+Negotiation+of+a+Metabolic+Checkpoint+in+Direct+Neuronal+Reprogramming.">Identification and Successful Negotiation of a Metabolic Checkpoint in Direct Neuronal Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).</li><li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells.">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 471-476 (2012).</li><li>Kleiderman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Nonproliferating+Astrocytes+into+Neurogenic+Neural+Stem+Cells:+Control+by+FGF2+and+Interferon-gamma.">Conversion of Nonproliferating Astrocytes into Neurogenic Neural Stem Cells: Control by FGF2 and Interferon-gamma.</a> Stem Cells. 34 (12), 2861-2874 (2016).</li><li>Bunk, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+Is+Required+for+Oligodendrocyte+Cell+Identity+in+Adult+Neural+Stem+Cells+of+the+Subventricular+Zone.">Prox1 Is Required for Oligodendrocyte Cell Identity in Adult Neural Stem Cells of the Subventricular Zone.</a> Stem Cells. 34 (8), 2115-2129 (2016).</li><li>Aravantinou-Fatorou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEND1+and+NEUROGENIN2+Reprogram+Mouse+Astrocytes+and+Embryonic+Fibroblasts+to+Induced+Neural+Precursors+and+Differentiated+Neurons.">CEND1 and NEUROGENIN2 Reprogram Mouse Astrocytes and Embryonic Fibroblasts to Induced Neural Precursors and Differentiated Neurons.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 405-418 (2015).</li><li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level.">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6 (2), 214-228 (2011).</li><li>Jimenez, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiation+of+ATP+calcium+responses+by+A2B+receptor+stimulation+and+other+signals+coupled+to+Gs+proteins+in+type-1+cerebellar+astrocytes.">Potentiation of ATP calcium responses by A2B receptor stimulation and other signals coupled to Gs proteins in type-1 cerebellar astrocytes.</a> Glia. 26 (2), 119-128 (1999).</li><li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties.">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).</li><li>Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+and+their+progeny.">Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny.</a> Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Yu, A. C., Lee, Y. L., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrogliosis+in+culture:+I.+The+model+and+the+effect+of+antisense+oligonucleotides+on+glial+fibrillary+acidic+protein+synthesis.">Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis.</a> J Neurosci Res. 34 (3), 295-303 (1993).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Одним из наиболее важных ценностей живых изображений является возможность выполнять точные линии трассировки, разъяснение критических аспектов линии прогрессии в нейронных населения. Трассировки линии определяется как идентификация и мониторинг всех потомков одного прародителя, от основателя клон для последующего клонирования сформировал21. Удивительно альтернативные методы, используемые для отслеживания (например, вирусный трансдукция или многоцветной репортер конструкции21) линии имеют критический недостаток, whereby окончательный результат основывается на фотографии и он не обязательно составляют всю последовательность. Это означает, что смерть клетки, неоднородности в поведении популяции клеток, разбавление, распространяя или плохой эффективности маркеров, наряду с другими важными недостатками, привести к неполной или неверной read-outs результаты2. Кроме того живой изображений позволяет исследователю проанализировать важные особенности биологии нейронных популяций, таких как режим и сроков деление клетки, рост клеток, миграция, распространение против дифференциации, длина клеточного цикла, neurite формирование, сложности и длины, ячейка выбор судьбы (дифференциации) или преобразования (перепрограммирование).
Кроме того, живой изображений можно легко дополнить другие анализа, предназначенный для получения данных из одной клетки, такие, как, например, РНК последовательности. Однако достижения комбинированных выгоды от живых изображений и других методов требует, чтобы те клетки, ранее контроль в кино являются позже повторно определены и индивидуально, собранные для вторичного анализа. Это может быть достигнуто с помощью Микроскопы, которые включают позиционные координат, путем применения флуоресцентные репортеров для конкретных ячеек или анализа распределения групп клеток как ссылки. Действительно сочетание транскриптом профиля и поведение отдельных клеток может представлять мощный маршрут для выяснения новых молекулярных сигналов, участвующих в биологии клетки.
Одной из основных проблем, которые могут подорвать живой эксперимент изображений является плотность культуры недостаточно клеток. Как указывалось ранее, при высокой плотности избыток мусора или бедных диссоциации (комок образование) могут повлиять на качество и пространственное разрешение изображений, делая невозможным одноклеточного отслеживания. Таким образом условия различных клеточных популяций под исследования должна быть скорректирована в наименьшее количество клеток возможно без ущерба для жизнеспособности клеточной культуры.
Частоту захвата изображений также имеет решающее значение и должны тщательно скорректированы, особенно когда используется флуоресцентной подсветки. Чрезмерное воздействие передается и особенно флюоресценция света может поставить под угрозу жизнеспособность клеток. Кроме того чрезмерная задержка между захвата изображений может мешать временное разрешение анализа.
Еще один важный шаг в живых изображений эксперимента является периодическая корректировка фокусировки. Неудача в правильный параметр/повторно-setting из Фокусное расстояние может препятствовать отслеживания одну ячейку. Кроме того необходимо тщательно проверить, что инкубации камера сохраняет надлежащей температуры, влажности и CO2 уровнях, изменения нежелательные изменения, которые могут вызвать смерть клетки.
Наконец после того, как была выполнена ПМКД, важно должным образом извлечь xyz нулевой позиции до последнего раунда захвата изображений. Неправильное повторное установление xyz нулевое положение сделает его трудным для соответствия фазово контрастной и иммунофлюоресценции изображения, препятствующие идентификации потомства ячейки.
Хотя этот подход имеет много положительных аспектов, по-прежнему сохраняются некоторые ограничения для живой съемки нейронных популяций. Например плотность низкая клеток, необходимых для выполнения успешной одноклеточного отслеживания aNSCs делает невозможным использовать биохимических анализов, например западной blotting14. Кроме того мониторинг, быстро деления населения как мозжечка астроциты или N2a клетки временно ограничен, как это часто слишком сложно отслеживать клетки как культур недалеко от впадения. Кроме того многие методы культуры, а также присущие биологические ограничения, связанные с изоляции клеток, часто компромисс жизнеспособность клеток более длительных периодов времени, ограничивая продолжительность живой изображений экспериментов. Наконец изоляция клетки из их естественной среды имеет позитивные и негативные последствия. Клетки изолированы от их физиологических ниши может не получать важные сигналы, которые модулировать их поведение, хотя в то же время, он представляет собой мощное средство для проверки эффекта этих сигналов индивидуально в прогрессии линии конкретных нейронных населения.
С учетом ограничений, описанных выше, становится ясно, что идеальный методологических сценарий будет выполнять жить изображений и одной ячейки отслеживания экспериментов в нормальных физиологических условиях в естественных условиях. Однако существующие методы не могут следовать одной клетки для длительных периодов времени в глубоких регионах мозга2. Таким образом будущее живых изображений следует сосредоточиться на преодолеть это ограничение, стремясь полностью проанализировать клеточной биологии из одной клетки в vivo с самых незначительных возможно вмешательство физиологической среды3.

Для того, чтобы разрабатывать новые и более эффективные терапевтические стратегии для регенерации нейронных популяций, мы должны сначала понять основные механизмы, которые поддерживают клетки с регенеративной нейронных потенциалом. Достижение этой цели требует всеобъемлющее знание факторов, которые регулируют баланс между покоя, распространения/дифференциация, режим и сроки отдела, длина клеточного цикла, мигрирующих потенциала, жизнеспособность, и т.д. Хотя это технический подход, который был нанят для многих лет1, живут изображений и непосредственного наблюдения по-прежнему остаются наилучшим вариантом для мониторинга событий, перечисленных выше. В отличие от многих других подходов сосредоточены на концевой отсчетов живут изображений и одноклеточного слежения предоставляют информацию по всей длине эксперимент2,3,4,5, 6. Таким образом, добавление временное разрешение позволяет смерть клетки, поведение неоднородной ячейки или ячейки судьба решений, а также многие критические события должны быть определены, которые в противном случае может пройти незамеченным. В идеале, эти функции клеток лучше всего должно контролироваться на одну ячейку уровня в естественных условиях, где обе внутренние (ячейка автономной) и внешние (клетки ниши) сигналы принимаются во внимание.
Однако, хотя в в vitro ситуации события происходят в среде, не воспроизводить естественной обстановке, условия low-density культуре, обычно используется в эти протоколы являются более подходящими выявить внутренние характеристики клетки. Кроме того более упрощенный контроль окружающей среды, просто изменив среднего роста, могут служить ценным инструментом для расследования индивидуальных роль каждого внешние фактор, который определяет нейронных нишу, а также экологические факторы, которые могут быть вызваны в патологических сценарии7,8,9,10,11,12,13. Поэтому когда правильно настроена, как и в протоколе, предлагаемые здесь, живой изображений обеспечивает решение осуществимо в пробирке для решения большинства вопросов, ранее перечисленных.
Короче говоря этот протокол описывает аппаратные средства, программное обеспечение, культуры условия и основные шаги, необходимые для успешного выполнения живых изображений эксперимент, следуют одной ячейки отслеживания. Этот подход обеспечивает ценную информацию, которая помогает выявить фундаментальные аспекты биологии и линии прогрессии, нескольких нейронных популяций.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0899</td>
			<td>Working solution 0.02 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 wells plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11869</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#946; III Tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP</td>
			<td>DakoCytomation</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945; Tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse FITC</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>715-095-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-2000-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ref 280MRH10101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ref 280MRH48230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pE-300 LED fluorescence</td>
			<td>Cool LED</td>
			<td>Ref Number 1981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>310M-201 Incubation system (temperature)</td>
			<td>OKO-Lab</td>
			<td>Serial N&#186; VOF007307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-ScanII&#160; Motorized stage system</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Serial N&#186; 60018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High precision microscope camera version 4.2</td>
			<td>ANDOR Zyla</td>
			<td>VSC-03650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OKO touch Incubation system (CO2)</td>
			<td>OKO-lab</td>
			<td>Serial number 1716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCCCCL131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution 1 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging followed by single cell tracking to monitor cell biology and the lineage progression of multiple neural populations

Понимание механизмов, которые контролируют критические события биологических нейронных клеточных популяций, например распространения, дифференциации или ячейки решения судьбы, будет иметь решающее значение для разработки терапевтических стратегий для многих заболеваний нервной системы. Нынешние методы для отслеживания клеточных популяций полагаются на их окончательные результаты в неподвижных изображений и они обычно не обеспечивают достаточной временное разрешение для выявления поведенческих особенностей в одиночных клетках. Кроме того изменения в смерти клетки, поведенческие гетерогенность популяции клеток, разбавление, распространение или низкая эффективность маркеров, используемых для анализа клеток являются все важные недостатки, которые приведут к неполной или неверной read-outs результатов. И наоборот живые изображения и одну ячейку, отслеживания соответствующих условиях представляет собой мощный инструмент для отслеживания каждого из этих событий. Здесь покадровой видео микроскопия протокол, следуют постобработки, описан отслеживать нейронных популяций с резолюцией одну ячейку, используя специальное программное обеспечение. Описанные методы позволяют исследователям для решения основных вопросов, касающихся клеток биологии и линии прогрессирования различных нейронных популяций.

Метод, описанный позволяет критические вопросы, касающиеся клеточной биологии нескольких нейронных популяций необходимо решить. Например было невозможно контролировать прогрессирование линии нейрогенных и oligodendrogliogenic aNSCs7,8,14,18. Отслеживание одного aNSCs и их потомства (рисунок 2A, B), можно продемонстрировать, что aNSCs было изолированных в vitro поддерживать их нейрогенной природы, в основном генерации нейробласты, и что они следуют последовательность предложил в VIVO19 , но не ранее продемонстрировали на уровне отдельной ячейки. Кроме того эта культура система позволила асимметричной клеточных делений для отображения в первый раз в aNSC линии от ОЭЗ (рис. 2B), предоставляя уникальную модель для изучения НСК самообновлению8,14. Аналогичным образом и независимо от линии проанализированы можно было получить ценные данные, касающиеся роста клеток, раундов отдела, жизнеспособность клеток или длина клеточного цикла.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig2.jpg"> 
Рисунок 2. Пример aNSCs изолированы от ОЭЗ и проанализированы живых изображений и одноклеточного отслеживания. Фаза контрастность изображения изображают прогрессирование клон в разное время точках (день h: мин). Окончательное изображение соответствует immunocytochemistry пост изображений (ПМКД) для глиальной фибриллово кислой белка (СВМС, красный), βIII-тубулина (зеленый) и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, синий). (A) анализ симметричный нейрогенный деревьев через различных раундов усиления подразделений сформировать после митотическая нейробласты. Красные стрелки указывают на клетки, включены в симметричных деревья. Справа отображаются линии деревьев соответствующий клонов и порожденных tTt программного обеспечения. (B) пример прародителя, генерации асимметричных нейрогенный дерево, с одной ветви, претерпевает усилительных отделах производить нейробласты в то время как другие порождает покоя СВМС позитивные клетки через потенциальных событий самообновления. Справа отображается дерево lineage, порожденных программного обеспечения ТТТ. В всех деревьев линии: «N» изображает пост митотическая нейробласты; «G», покоя СВМС положительных клеток; «X», гибель клеток; и «?» утраченных клеток. Линейки шкалы представляет 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Живут изображений и одноклеточного отслеживания анализа также обеспечивает точная индикация мигрирующих мощностей нейронных населения. Такая информация была получена от послеродового мозжечковой астроциты, представленные до нуля рану пробирного20, генерации информации относительно среднее расстояние, пройденное астроциты, при закрытии раны (рис. 3). Кроме того это было можно увидеть, что некоторые из астроцитов разделены во время процесса заживления, в то время как другие остаются неизменными на протяжении всего эксперимента. Поразительно те, которые разделены кажется более плодовитым мигрирующих поведение, чем их коллеги деления-(путешествуя два раза, как далеко в среднем). Это явление предлагает очень интересные гетерогенность в астроциты способность сформировать шрам после травмы, которая бы было разбавлено вне в считывания классической концевой анализ эксперимента.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig3.jpg"> 
Рис. 3. Анализ поведения мигрирующих послеродовой мозжечковой астроциты в нуля раны assay. Фаза контрастность изображения изображают рану в разное время точках (день h: мин). Линии деревьев, порожденных программного обеспечения tTt, иллюстрируют представитель поведение, с точки зрения деления клеток, из астроцитов при закрытии раны. Гистограмма показывает среднее расстояние, пройденное астроциты, анализируемой одноклеточного отслеживания (среднее ± S.E.M.). Линейки шкалы представляет 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Еще одна интересная особенность покадровой видео микроскопия экспериментов является способность сравнивать пролиферации и дифференцировки в популяции клеток. Мы протестировали N2a клетки, покрытие в условиях, которые способствуют распространению (в присутствии 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)) или дифференциации (при наличии 0,5% FBS + 10 мкм арахидоновой кислоты). Это было можно проследить происхождение прогрессирование эти клетки при пролиферативных условиях (Рисунок 4A), тогда как дифференцирования клетки не размножаются и образуют невритов (Рисунок 4B). Удивительно одна ячейка отслеживания допускается колоний с различными распространение потенциала следует отличать neurite удлинение (и Ретракция) оцениваться, обеспечивая точный и количественные данные, которые впоследствии могут быть экспортированы.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig4.jpg"> 
Рисунок 4. Мониторинг N2a клеточной биологии в распространение (A) или дифференциации условий (B). Фаза контрастность изображения изображающие прогрессирование клон в разное время точках (день h: мин). Окончательное изображение соответствует immunocytochemistry пост изображений (ПМКД) для α-тубулина (зеленый). (A) одной ячейки отслеживания позволяет раундов отдела контролироваться, а также неоднородность в Пролиферативная реакция различных клеток. Справа дерево lineage, порожденных программного обеспечения tTt иллюстрирует пролиферативной поведение N2a клеток. (B) клеток условиях дифференциации выход клеточного цикла и генерировать невритов, процесс, который может быть эффективно измеряется после визуализации анализа. Одноместный ячейки отслеживания, представленный деревом линии справа, показывает, как клетки N2a выход клеточного цикла и остановка деления клеток условиях дифференциации. Линейки шкалы представляет 50 мкм.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Наконец, живут изображений и одноклеточного отслеживания является чрезвычайно полезным для мониторинга молекулярных и морфологических изменений, когда клетки принимаются для перепрограммирования. Живой изображений послеродовой астроциты, преобразованы с Achaete жучка гомолога 1 (Ascl1) обеспечивает ценные данные относительно морфологических изменений, которые происходят во время перепрограммирования или блокирования деления клеток, когда астроциты перепрограммировать (см. Рисунок 5). Кроме того, когда Ascl1 трансдукции сочетается с трансдукции конструкции кодировки для зеленых флуоресценции белков (ГПУП) под контролем промотора двойной Cortin (DCX), это можно определить точки точное время, когда нейронов определенных маркеров начинают быть выражены в перепрограммировать клетки (рис. 5). Покадровой видео микроскопия позволяет также количество ячеек, которые успешно завершить перепрограммирования количественно и по сравнению с клетки, которые умирают во время этого процесса. Мониторинг таких мероприятий привело к идентификации критических «контрольно-пропускных пунктов», в клетках, которые были успешно перепрограммировать9.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56291/56291fig5.jpg"> 
Рисунок 5. Анализ послеродового корковых астроциты, подвергается нейрональных перепрограммирования. Перепрограммирование было вызвано трансдукция с про нейрогенных Ascl1-красной флуоресценции белков (RFP) векторов. Нейрональных преобразования контролируется совместно трансдукция с вектор кодирования GFP под контролем промотора DCX. Фаза контраст изображения показывают прогрессирование перепрограммирования в разное время точках (день h: мин). Флуоресценции изображения ППП и GFP выражения, соответственно. Живут изображений и одноклеточного отслеживания позволили важных событий для подражания, например морфологических изменений, отсутствие деления клеток во время перепрограммирования, гибель клеток, и точное время, когда перепрограммировать клетки начинают выразить нейрональных маркеры могут быть определены . Представляет линейку 80 мкм. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56291/56291fig5large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations at JoVE.com

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Живой изображений, следуют одной ячейки отслеживания для мониторинга клеточной биологии и прогрессирования Lineage нескольких нейронных популяций

Описан надежный протокол контролировать нейронных популяций покадровой видео микроскопия, следуют программного обеспечения-пост-обработки. Этот метод представляет собой мощный инструмент для выявления биологических события в выбранной популяции во время живых изображений экспериментов.

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Живая съемка Спинной Аксоны Корневая после ризотомия

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Анализ нейронной миграции Крест и дифференциация по межвидовой трансплантации

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Оптическая запись запороговой нейронной активности с одноклеточных и одного всплеска резолюции

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Экс естественных Живая съемка Одноместный клеточных делений в мышь нейроэпителия

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Выделение различных клеточных популяций из развивающихся мозжечка микродиссекции

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Сотовый Сортировка нейронных стволовых и прогениторных клеток из взрослых мышей субвентрикулярной зоны и Live-визуализация клеточного цикла динамика

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Изоляция и культивирование нервных прародителей, следуют иммунопреципитации Chromatin гистона 3 лизина 79 Dimethylation марки

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...