Name: quantification of information encoded by gene expression levels during lifespan modulation under broad-range dietary restriction in c. elegans
Uploaded: 2017-08-16T15:00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans at JoVE.com

Agradecemos a los laboratorios de Bargmann y Horvitz de reactivos. Algunas cepas fueron proporcionadas por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). También agradecemos a M. Lipovsek para comentarios sobre el manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Wellcome Trust (proyecto de subvención 087146 a Q.C.), BBSRC (1/H020500/BB y BB/M00757X/1 a Q.C.), Consejo Europeo de investigación (NeuroAge 242666 a Q.C.), nos institutos nacionales de salud (R01AG035317 y R01GM088333 a H.L.) y Estados Unidos Fundación de ciencia nacional (0954578 a H.L., 0946809 GRFP a M.Z.).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, presentamos un nuevo método de restricción dietética que encapsula una gama mucho más amplia de alimentos concentraciones de protocolos previamente publicados. Este método enlaza dos fenómenos separados previamente vistos en literatura Dr. C. elegans , bacteriana privación y restricción dietética clásica, permitiendo ambos efectos dietéticos a ser estudian bajo un protocolo. Con el nuevo paradigma del Dr. amplio-gama, presentamos un marco general para examinar la expresión de gene de la célula en respuesta a una señal ambiental específica y determinar cómo este celular codifica la información. Nuestro marco consta de dos protocolos experimentales que ilustran cómo realizar las esperanzas de vida y la proyección de imagen cuantitativa, respectivamente, bajo amplia gama DR. Data de estos protocolos experimentales se pueden examinar luego con el análisis computacionales en este marco para cuantificar la información codificada por los cambios en los niveles de expresión génica o duración de la vida en condiciones diferentes.
Experimentos de la vida útil utilizando amplia gama Dr. paradigma implican seis niveles distintos alimentos (tabla 1). Esto requiere un enfoque más intensivo que examinando longevidad bajo menos niveles de alimentos, tales como privación dietética10,11 o usando el fondo genético de comer-2 35. Sin embargo, examinar en vida útil bajo una única condición puede limitar las interpretaciones del papel de un gen en República Dominicana. Por ejemplo, recientemente demostró que daf-7 mutantes tienen una atenuación bidireccional de la respuesta a la concentración de alimento en comparación con el tipo salvaje animales12 (figura 1A). En ausencia de alimentos, daf-7 mutantes muestran un acortamiento de su vida útil en comparación con animales de tipo silvestre. Si sólo habíamos considerado privación dietética, habría interpretado que el gen daf-7 como sea necesario para sólo extensión de vida útil, cuando en realidad el papel de la daf-7 es más complejo. Por lo tanto, el resultado fundamental de esta parte del protocolo es establecer si un gen de interés involucrados en la modulación de la respuesta de vida a los cambios en la abundancia de alimentos.
Una ventaja importante de este protocolo en comparación con otros métodos es que utiliza un novedoso método para eliminar la producción de progenie en los animales sometidos a análisis de vida útil. Mayoría de los estudios usa la droga FuDR para inhibir la proliferación de la línea germinal en adultos hace estéril. Sin embargo, estudios recientes han demostrado FuDR tratamiento puede tener efectos de condición gene-específicas y vida17,18,19,20,21, en cuestionar su aplicabilidad general. En este protocolo, eliminación de la producción de progenie se logra a través de una 24 h tratamiento de animales con RNAi contra el gen del huevo-5 , que inhibe la formación de la cáscara de huevo de quitina de fertilizado C. elegans ovocitos resultantes en su la muerte de22,23. La ventaja de este método es que es muy tarde y así no interferir en la línea germinal, que es un regulador importante de la longevidad en C. elegans.
Una advertencia potencial del protocolo amplia gama DR es su dependencia en el uso de los antibióticos para controlar la proliferación bacteriana para garantizar un control estricto de la concentración bacteriana. Proliferación bacteriana en el intestino del gusano es conocido por ser una de las principales causas de muerte en C. elegans16. Así, el uso de antibióticos bacteriostáticos, como carbenicilina, en agar NGM previene la proliferación bacteriana y aumenta la vida útil de gusanos en comparación con controles no antibiótico16. Ciertos tipos de antibióticos como la rifampicina36 y miembros de la familia37,de tetraciclina38, se ha demostrado para prolongar esperanza de vida en C. elegans independientemente de su efecto sobre bacterias proliferación. Sin embargo, no hay ninguna evidencia en la literatura que carbenicilina o estreptomicina puede aumentar la longevidad independientemente de su efecto sobre la proliferación bacteriana.
Vida útil puede verse como el resultado de un cálculo complejo donde la información ambiental, encaminado por la expresión génica en redes neuronales, se transmite a la fisiología. Nuestro protocolo proporciona una metodología para entender cómo determinados genes afectan este flujo de información ambiental. Para abordar esta cuestión, necesitamos imagen fiable de procesamiento para determinar la distribución de las respuestas de expresión génica a nivel unicelular. Ser capaz de calcular no sólo la respuesta promedio de la expresión génica a cambios en la abundancia de alimentos sino también la distribución completa estadística de grandes poblaciones representa un requisito importante para la aplicabilidad de nuestro método. Esta descripción exacta de las respuestas de expresión génica a la abundancia de alimentos permite la aplicación de la teoría de la información cuantificar la información codificada por las neuronas específicas, así como la estrategia de codificación empleada por el circuito neural.
Los aspectos de imagen y computacionales de los métodos descritos en este protocolo son aplicables a un conjunto mayor de contextos biológicos. En nuestro trabajo, nos centramos en una pequeña red neuronal en alimentos detección, sin embargo, el análisis de las características de procesamiento de la información no se limitan a un tipo de célula específica o señales ambientales específicos. En el futuro, estas metodologías pueden extenderse potencialmente a una mayor variedad de variables de entrada, que afectan a cualquier salida fisiológica. Estos enfoques contribuirá a una mayor comprensión de cómo codificar redes reguladoras del gene, proceso y transmitir información.

Todos los organismos deben ser capaces de detectar y responder a los cambios en el entorno para asegurar su supervivencia. En los animales, el sistema nervioso es el detector primario y el transductor de información sobre el medio ambiente y coordina la respuesta fisiológica a cualquier cambio que pudiera afectar supervivencia1 del organismo. Abundancia de alimentos es un cue ambiental que se ha estudiado bien en varios contextos que no sólo regula comportamientos relacionados con la alimentación, como forrajeo2, sino que también afecta a la longevidad de un animal. La modulación de duración por los cambios en la abundancia de alimentos es un fenómeno conocido como restricción dietética (DR) y tiene amplia conservación evolutiva3.
El nematodo Caenorhabditis elegans es un sistema potente para resolver cuestiones biológicas fundamentales. Se han desarrollado una gran cantidad de técnicas que permiten la manipulación del genoma del gusano, como gene de RNAi y en vivo técnicas de edición. El pequeño tamaño físico de la lombriz y su transparencia óptica también se prestan en vivo la proyección de imagen de tanto transcripcionales y traduccional reporteros fluorescentes y utilidad de las tecnologías de alto rendimiento como la microfluídica4. Juntos, se pueden aprovechar estas herramientas para examinar cómo neuronal circuitos directo comportamiento de los animales.
C. elegans es un bacterivore y se han publicado varios métodos que permiten el control preciso de la abundancia de alimentos mediante la manipulación de concentración bacteriana5,6,7,8 . Dentro de la comunidad de investigación de C. elegans , DR ha sido estudiado en dos contextos diferentes. El primero puede ser denominado 'clásico DR', refleja los cambios en respuesta a la disminución de los niveles de alimentos en otros organismos. En este contexto, disminuir la abundancia de alimentos de los niveles de ad libitum resulta en una vida cada vez más hasta que se llega a un grado óptimo, después de que la longevidad de este punto disminuye con la reducción adicional de alimentos6,7, 9. El segundo contexto bajo el cual el Dr. ha sido estudiado en C. elegans es privación dietética en la que se incrementa la longevidad de los gusanos de la eliminación completa de cualquier fuente de alimentación bacteriana10,11. En Entchev et al., (2015)12, demostramos que la complejidad de la DR resultante de estos dos paradigmas diferentes puede examinarse simultáneamente bajo un contexto llamamos 'amplia gama DR'. Mediante el protocolo descrito a continuación, identificamos una nueva clase de genes Dr. eso bidireccional modular la respuesta de vida a la abundancia de comida y participan en circuitos neurales que percibir alimentos12 (figura 1).
La respuesta de un animal a los cambios en el ambiente integra una secuencia de procesos biológicos que vinculan el sistema sensorial a complejas interacciones reguladoras transmitir información ambiental a la fisiología. Aunque los detalles mecanicistas de tal "flujo de información" son a menudo desconocidos, herramientas genéticas pueden utilizarse para adquirir una visión de cómo está organizado este cómputo complejo entre diferentes componentes biológicos. En nuestro reciente trabajo, mostramos que daf-7 y tph-1 están implicadas en la transmisión de información ambiental sobre la abundancia de alimentos a través de un circuito neural detección de alimentos que modula la esperanza de vida en C. elegans12 , 13. aplicando el marco matemático de la teoría de la información14, hemos sido capaces de cuantificar la cantidad de información ambiental, en términos de bits, que está representado por los cambios de expresión génica en daf-7 y tph-1 en las neuronas específicas a través de niveles diferentes. De esta forma, entonces fuimos capaces de descubrir la estrategia de codificación empleada por este circuito neural y cómo se controla genéticamente (figura 2).
En el siguiente protocolo, describiremos los pasos necesarios para entender cuáles son los efectos de los genes de interés expresado en neuronas específicas y cómo participan para el flujo de información de alimentos del entorno a la vida. En términos generales, nuestro marco se divide en dos protocolos experimentales y un flujo de trabajo computacional. Para los aspectos experimentales, es crítico contar con mutantes de los genes de interés que puede ser examinado bajo amplia gama reporteros transcripcionales DR. Faithful también son necesarias para cuantificar el nivel de expresión de los genes a nivel de diferentes alimentos. Para poder llevar a cabo el análisis computacional en nuestro método, el conjunto de datos debe ser de tamaño suficiente para proporcionar estimaciones significativas de distribuciones de expresión. Aunque proporcionamos códigos de fuente de plantilla para el análisis, el usuario debe estar familiarizado con el lenguaje de la teoría de la información que se utiliza ampliamente a lo largo de nuestro marco computacional. El código fuente escrito en R y C++. Por lo tanto, un cierto nivel de conocimientos de programación es también necesario para aplicarlos de una manera significativa.

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	<colgroup>
		<col style="width:177pt" width="236" />
		<col style="width:67pt" width="89" />
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		<col style="width:153pt" width="204" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:177pt;height:30.0pt" width="236">Carbenicillin di-Sodium salt</td>
			<td class="xl18" style="width:67pt" width="89">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:68pt" width="91">C1389-5G</td>
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		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">Streptomycin Sulphate salt</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">S6501-50G</td>
			<td class="xl18">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">&#160;Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">I6758-10G</td>
			<td class="xl18">Inducer for RNAi plates</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">71380-1KG-M</td>
			<td class="xl18">Used in S basal, and NGM agar</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4)</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">1.05104.1000</td>
			<td class="xl18">Used in S basal, and NGM agar</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">P9791-1KG</td>
			<td class="xl18">Used in S basal, and NGM agar</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl19" height="40" style="width:177pt;height:30.0pt" width="236">Magnesium Sulphate (MgSO4)</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">M2643-1KG</td>
			<td class="xl18">Used in NGM agar</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl19" height="40" style="width:177pt;height:30.0pt" width="236">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">C5670-500G</td>
			<td class="xl18">Used in NGM agar</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl19" height="40" style="width:177pt;height:30.0pt" width="236">Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">71687-500G</td>
			<td class="xl18">Used for bleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl19" height="40" style="width:177pt;height:30.0pt" width="236">Pluronic-F127</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">P2443-1KG</td>
			<td class="xl18">Used in imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl19" height="40" style="width:177pt;height:30.0pt" width="236">Sodium Hypochlorite (NaClO)</td>
			<td class="xl18">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18">1.05614.2500</td>
			<td class="xl18">Used for bleaching</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">LB Broth</td>
			<td class="xl18">Invitrogen</td>
			<td class="xl20">12780052</td>
			<td class="xl18">Used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates</td>
			<td class="xl18">Greiner Bio-One</td>
			<td class="xl21" style="width:68pt" width="91">628960</td>
			<td class="xl18">Plates for lifespan</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">CellStar 10cm Tissue Culture plates</td>
			<td class="xl18">Greiner Bio-One</td>
			<td class="xl20">664160</td>
			<td class="xl18">Plates for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">Low Retention P200 tips</td>
			<td class="xl18">Brandt</td>
			<td class="xl20">732832</td>
			<td class="xl18">Tips for handling worms in liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">Agar</td>
			<td class="xl18">BD</td>
			<td class="xl20">214510</td>
			<td class="xl18">Agar for NGM, RNAi and NSC plates</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="height:30.0pt">Bacto-peptone</td>
			<td class="xl18">BD</td>
			<td class="xl20">211820</td>
			<td class="xl18">Peptone for NGM, RNAi and NSC plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of information encoded by gene expression levels during lifespan modulation under broad-range dietary restriction in c. elegans

Los sistemas sensoriales permiten animales detectar, procesar y responder a su entorno. Abundancia de alimentos es una señal ambiental que tiene profundos efectos sobre la conducta y fisiología animal. Recientemente, demostró que la modulación de la longevidad en el nematodo Caenorhabditis elegans por abundancia de alimentos es más complejo que reconocido previamente. La capacidad de respuesta de la vida a los cambios en el nivel de alimento está determinado por genes específicos que actúan mediante el control de procesamiento dentro de un circuito neural de la información. Nuestro marco combina el análisis genético, proyección de imagen de alto rendimiento cuantitativo y teoría de la información. Aquí, describimos cómo estas técnicas pueden utilizarse para caracterizar cualquier gen que tiene una relevancia fisiológica a la restricción dietética de amplia gama. Específicamente, este flujo de trabajo está diseñado para mostrar cómo un gen de interés regula vida útil bajo restricción dietética de la amplio-gama; a continuación, para establecer cómo la expresión del gen varía con el nivel de alimentación; y por último proporcionar una cuantificación objetiva de la cantidad de información transmitida por genes sobre abundancia de alimento en el medio ambiente. Cuando varios genes se examinan simultáneamente en el contexto de un circuito neural, este flujo de trabajo puede descubrir la estrategia de codificación empleada por el circuito.

Mediante la realización de experimentos de vida en los mutantes de los genes de interés junto con el tipo tensión de N2, uno puede establecer si estos genes tienen un papel en la respuesta alimentaria al DR de la amplio-gama. La respuesta de tipo salvaje debe ser comparable a la representada en la figura 1A. Cualquier modulación de esta respuesta por los mutantes, reflejado por un efecto no uniforme en condiciones de alimentación, indica que estos genes afectan la capacidad del gusano de responder correctamente a los cambios en la abundancia de alimentos, en que punto de la posterior investigación de la las respuestas de la expresión de estos genes a DR de la amplio-gama está garantizado. Si, sin embargo, la respuesta de la longevidad de los mutantes no es significativamente diferente del tipo salvaje los genes no tienen ningún papel en la transducción de los efectos de la amplio-gama DR, al menos en el nivel de vida promedio. Si las mutaciones causan un cambio uniforme de la respuesta de vida todo los genes tienen un efecto independiente de la alimentación sobre la duración. Esto no descarta la posibilidad de que la expresión de los genes de interés es alimentos sensibles, en cuyo caso la información transportada por estos genes no se transmite a la vida.
La próxima etapa del protocolo es determinar cómo cambian los niveles de expresión bajo amplia gama de DR para los genes de interés. En la figura 1B, ilustramos esto a través de los niveles de expresión de un reportero transcripcional de daf-7, que muestra una respuesta a los cambios en el nivel de alimento en las neuronas sensoriales ASI. En un mutante de daf-7(-) , se altera la respuesta de la expresión del reportero transcripcional. Si los genes de interés son realmente en capacidad de respuesta en el nivel de vida se puede esperar que su expresión también cambiará con la comida. Correspondientemente, un reportero transcripcional en el fondo mutante debe tener un perfil de expresión alterada en respuesta a DR de la amplio-gama. Sin embargo, también es posible que el reportero transcripcional del gen de interés en un fondo de tipo salvaje no muestra los alimentos sensibles cambios en la expresión. En esta situación, esto puede indicar un efecto regulador postranscripcional que cae fuera del alcance de este protocolo.
En Diana et al., (2017)13, se obtuvieron valores de expresión para daf-7 en ASI y tph-1 ADF y NSM. En la figura 2A, ilustramos la estimación de la distribución de la expresión en ASI y ADF para un nivel determinado de alimentos. Tener múltiples lecturas de imágenes único gusano nos permite analizar no sólo la cantidad de información codificada en forma independiente por cada neurona, sino también la información combinatoria del circuito entero neuronal (figura 2B-2 C). La combinación de estas dos medidas información teórica nos permite caracterizar el sistema en términos de la estrategia de codificación empleado por las neuronas para transmitir información sobre la comida. La cantidad de redundancia en el circuito puede obtenerse tomando la suma de la información mutua para cada neurona y restando la información mutua común (capacidad de canal) obtenida considerando las lecturas combinatorias del circuito. Un valor positivo de tal diferencia denota un carácter redundante de la estrategia de codificación debido a que la información acumulada entre las partes es mayor que la real información codificada por todo el circuito. Por el contrario, un valor negativo refleja una estrategia sinérgica porque la verdadera información es mayor que la suma de sus componentes (figura 2B). Información y redundancia pueden ser comparados a través de diferentes genotipos para explorar posibles funciones de orden superiores de regulación génica, por ejemplo en Diana et al. (2017) 13 el efecto del daf-7 mutación cambia la estrategia de codificación de redundancia sinérgica (figura 2C-2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig1.jpg"> 
Figura 1 : Respuesta de esperanza de vida y expresión genética bajo amplia gama DR. (A) la media vida del salvaje tipo tensión de N2 (línea negra) muestra una respuesta compleja a DR de la amplio-gama. Se atenúa la magnitud de esta respuesta en un mutante nulo del gen daf-7 (línea roja). Barras de error representan el error estándar de la media, los datos agrupados de Entchev et al. (2015) 12. niveles de expresión (B) la media de un reportero transcripcional del gen daf-7 fondo de tipo salvaje (línea negra) también muestran una respuesta no monotónica complejo a DR de la amplio-gama. En fondo genético daf-7(-) la expresión de este reportero transcripcional es altamente atenuada y muestra poca respuesta a los cambios en el nivel de alimento. Barras de error representan el error estándar de la media, los datos de un único ensayo en Entchev et al. (2015) 12. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig2.jpg"> 
Figura 2 : Metodología computacional. (A) ilustración de la estimación de densidad de dos dimensiones de expresión de la tph-1 en ADF y daf-7 expresión ASI como obtener el paquete de 'ks' R con una dimensión de rejilla 30 x 30. (B) visualización de la información codificada por la expresión conjunta de tph-1 y 7 de daf (entero) e individualmente (suma de partes) para las neuronas ADF, ASI y NSM. Caracteres redundantes y sinérgicos de la codificación están representadas por la diferencia entre la altura de las barras apiladas a la derecha y la información codificada por el circuito completo. (C) comparación entre información alimentaria de animales de tipo silvestre y mutantes daf-7(-) . (D) la reducción de la información mutua observado en los mutantes es acompañado por un interruptor hacia codificación sinérgico. Paneles B, D se adaptan de Diana et al. (2017) 13. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Concentración bacteriana (células/ml)</td>
			<td>Densidad óptica (600 nm)</td>
			<td>Factor de dilución (de anterior)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.12E + 10</td>
			<td>56.000</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E + 09</td>
			<td>10.000</td>
			<td>5.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E + 08</td>
			<td>3.160</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E + 07</td>
			<td>0,316</td>
			<td>10.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E + 07</td>
			<td>0.100</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 (S basal)</td>
			<td>0.000</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: niveles de alimentación y factores de dilución utilizados en el DR. de la amplio-gama Bacteriasl las concentraciones (células/mL) utilizadas en el protocolo del DR de amplia gama, junto con sus respectivas mediciones de600 de OD y el factor de dilución requerido para alcanzar cada concentración de la anterior.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="7">Temperatura experimental de vida útil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Día</td>
			<td>12,5 ° C</td>
			<td>15° C</td>
			<td>17,5 ° C</td>
			<td>20° C</td>
			<td>22.5° C</td>
			<td>25° C</td>
			<td>27,5 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td colspan="7">Pedazo de todas las cepas a placas NGM frescas y se mantiene a 20° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td colspan="7">Configurar P0 generación de cepas daf-7(-) y mantener a 20° C (1 L4 por placa, 5 placas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td colspan="7">Configurar P0 generación de cepas de tipo salvaje y mantener a 20° C (1 L4 por placa, 5 placas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td colspan="7">Configurar la generación F1 de cepas daf-7(-) y mantener a 20° C (1 L4 por placa, 90 placas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td colspan="7">Configurar la generación F1 de las cepas de tipo salvaje y mantener a 20° C (1 L4 por placa, placas de 30)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="7">Recoger las larvas L4 de F2 a &#62; ARNi de huevo-5 placas y mantener a 20° C (15 L4 por placa, placas de 24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="7">Hacia adultos 1 día - la vieja de NSC placas sembradas con 2, 0E + nivel de alimentos de 9 células/ml y se mantiene a 20 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="7">Pasar 2 días de edad adultos NSC placas sembradas con las condiciones experimentales alimentaria y temperatura experimental</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>Transferencia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: calendario de duración de la vida llevó a cabo a diferentes temperaturas. Resumen esquemático de los pasos necesarios para configurar amplia gama DR vida experimentos a diferentes temperaturas, utilizando cepas de tipo salvaje y daf-7(-) como ejemplos. El número de transferencias a platos frescos de cada nivel de comida experimental disminuye con el aumento de temperatura. Esto es para tener en cuenta el hecho de que los animales a temperaturas más altas están envejeciendo más rápidamente y por lo tanto más propensas a daños por transferencia.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Días</td>
			<td>IMA</td></tr></tbody></table>Ging tubería
		
		<tr>
			<td>-14</td>
			<td>Pedazo reportero cepas en daf(-) fondo. Mantener a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-13</td>
			<td>Pedazo reportero cepas tipo salvaje de fondo. Mantener a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td>Configurar P0 generación de cepas de reportero daf-7(-). Utilice 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 2 placas y se mantiene a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td>Configurar P0 generación de cepas de tipo salvaje reportero. Utilice 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 2 placas y se mantiene a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td>Configurar la generación F1 de daf-7(-) cepas de reportero. Utilice 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 12 placas y se mantiene a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td>Configurar la generación F1 de cepas de tipo salvaje reportero. Utilice 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Use placas de 4 y se mantiene a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td>Bleach daf-7(-) cepas de reportero en la tarde (~ 5 pm) y depositar huevos en 3 planchas NGM de 10cm y se mantiene a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td>Bleach tipo salvaje reportero cepas mañana (~ 10 m) y depósito de huevos en cm 3 10 planchas NGM y mantener a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>Lavar L4 a placas de ARNi de huevo-5 de 10 cm. Usar 3 placas por cepa y mantener a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Lavar 1 día adultos NSC placas sembradas con 2, 0E + 9 células / ml. Utilice 3 placas por cepa y mantener a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Lavado 2 días adultos a placas de NSC sembradas con niveles de alimento experimental. Utilice 3 placas por cepa y cambio a temperatura experimental.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Traslado a nuevas placas de NSC. Utilizar 3 placas por tensión y se mantiene a temperatura experimental.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Traslado a nuevas placas de NSC. Utilizar 3 placas por tensión y se mantiene a temperatura experimental.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Recoger animales de las placas y prepararse para la proyección de imagen.</td>
		</tr>
	

Tabla 3: calendario de tubería la proyección de imagen. Resumen esquemático de los pasos necesarios para configurar la amplio-gama DR experimentos utilizando cepas fluorescentes reportero transcripcional en fondos daf-7(-) y tipo salvaje a diferentes temperaturas como ejemplos la proyección de imagen.

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Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Cuantificación de la información codificada por el Gene expresión niveles durante la vida útil modulación bajo amplia gama dieta restricción en C. elegans

Aquí, presentamos un marco que se relacionan con restricción dietética de la amplio-gama de vida y expresión génica. Se describen los protocolos para la restricción dietética de la amplio-gama y para la proyección de imagen cuantitativa de la expresión génica bajo este paradigma. Contorneamos más análisis computacionales para revelar subyacentes características de procesamiento de información de los circuitos genéticos implicados en la detección de alimentos.

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Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

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Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...