Name: quantification of monocyte transmigration and foam cell formation from individuals with chronic inflammatory conditions
Uploaded: 2017-10-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions at JoVE.com

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor het werk van Prof. William Muller en Dr. Clare Westhorpe voor hun sleutelrol in de ontwikkeling van eerdere iteraties van dit model. De auteurs ook bedank de AMREP Stroom Cytometry kern voor het sorteren van monocyt deelverzamelingen en de Alfred besmettelijke ziekte ziekenhuisafdeling klinische onderzoek verpleegkundigen voor de aanwerving van HIV + personen voor sommige studies. De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor de bijdrage aan dit werk voor de Victoria operationele infrastructuur Support Program ontvangen door het Instituut Burnet. TAA wordt ondersteund door een RMIT University Vice-kanselier van postdoctorale Fellowship. Dit werk werd gesteund door NHMRC projectsubsidie 1108792 toegekend aan AJ en AH. TK wordt ondersteund door NIH grants NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.

Opmerking: alle experimenten met behulp van de menselijke biologische monsters werden uitgevoerd met goedkeuring van de ethiek van de Alfred ziekenhuis menselijke ethische Commissie, Melbourne. Alle experimenten werden uitgevoerd in klasse II bioveiligheid kasten, tenzij aangegeven. &#34; Prewarmed &#34; verwijst naar reagentia opgewarmd tot 37 ° C in waterbaden.
 1. voorbereiding van Type I vezelig collageen Gels: dag 1 <ol><li>voorbereiden polymeervorm collageen gels door sequentieel toe...

<ol>
	<li>Napoli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+streak+formation+occurs+in+human+fetal+aortas+and+is+greatly+enhanced+by+maternal+hypercholesterolemia.+Intimal+accumulation+of+low+density+lipoprotein+and+its+oxidation+precede+monocyte+recruitment+into+early+atherosclerotic+lesions.">Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).</li><li>Woollard, K. J., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+in+atherosclerosis:+subsets+and+functions.">Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.</a> Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foamy+Monocytes+Form+Early+and+Contribute+to+Nascent+Atherosclerosis+in+Mice+With+Hypercholesterolemia.">Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).</li><li>Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very-low+and+low-density+lipoproteins+induce+neutral+lipid+accumulation+and+impair+migration+in+monocyte+subsets.">Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets.</a> Scientific Reports. 6, 20038 (2016).</li><li>Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+foam+cell+formation+in+chronic+inflammatory+disease.">Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease.</a> Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).</li><li>Llodr&#225;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emigration+of+monocyte-derived+cells+from+atherosclerotic+lesions+characterizes+regressive,+but+not+progressive,+plaques.">Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atherosclerosis.">Animal Models of Atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).</li><li>Meir, K. S., Leitersdorf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+in+the+Apolipoprotein+E-Deficient+Mouse.+A+Decade+of+Progress.">Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).</li><li>Hilgendorf, I., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+difference:+Monocyte+Heterogeneity+in+Cardiovascular+Disease.">Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease.</a> Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+Apo+A-I+and+Lower+HDL-C+Levels+Are+Associated+With+Higher+Intermediate+CD14++CD16++Monocyte+Counts+That+Predict+Cardiovascular+Events+in+Chronic+Kidney+Disease.">Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++Monocytes+Independently+Predict+Cardiovascular+Events:+A+Cohort+Study+of+951+Patients+Referred+for+Elective+Coronary+Angiography.">CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chemotactic+Effect+Of+Mixtures+Of+Antibody+And+Antigen+On+Polymorphonuclear+Leucocytes.">The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+activation+promotes+foam+cell+formation+by+monocytes+following+transendothelial+migration+in+an+in+vitro+model.">Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model.</a> Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).</li><li>Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+modified+low+density+lipoproteins:+a+potential+role+in+recruitment+and+retention+of+monocyte/macrophages+during+atherogenesis.">Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).</li><li>Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+macrophage+degradation+of+biologically+modified+low+density+lipoprotein.">Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).</li><li>Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+Low-Density+Lipoprotein.">Oxidized Low-Density Lipoprotein.</a> Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).</li><li>Muller, W. A., Weigl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-selective+transendothelial+migration:+dissection+of+the+binding+and+transmigration+phases+by+an+in+vitro+assay.">Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay.</a> J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).</li><li>Maisa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+from+HIV-infected+individuals+show+impaired+cholesterol+efflux+and+increased+foam+cell+formation+after+transendothelial+migration.">Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration.</a> AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).</li><li>Angelovich, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+foam+cell+formation+is+enhanced+in+monocytes+from+older+individuals+by+both+extrinsic+and+intrinsic+mechanisms.">Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms.</a> Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).</li><li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HIV-1+infection+in+vitro+on+transendothelial+migration+by+monocytes+and+monocyte-derived+macrophages.">Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages.</a> J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).</li><li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current.">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).</li><li>M&#252;ller, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Endothelial+Markers+PECAM-1,+vWf,+and+CD34+in+Vivo+and+in+Vitro.">Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro.</a> Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).</li><li>Kelesidis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+impaired+HDL+function+in+HIV-1+infected+compared+to+uninfected+individuals.">Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Gacka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+and+atherogenic+activity+of+monocytes+in+Type+2+diabetes.">Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes.</a> J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+and+cardiovascular+outcome+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease.</a> Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).</li></ol>

Het protocol hier beschreven biedt een veelzijdig en fysiologisch relevante methode voor de beoordeling van de atherogenicity van monocyten van menselijke klinische cohorten, door zowel monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming te combineren. Dit model biedt voordelen ten opzichte van alternatieve methoden van schuim celvorming zoals het rekening houden met het effect van de monocyt zielsverhuizing op schuim celvorming en de meting van omgekeerde transmigratie6 naast de inherente laat neiging v...

Monocyt transmigratie is een cruciale stap in de ontwikkeling van atherosclerotische plaque die tot trombose, beroerte en een hartinfarct leiden kan. Atherosclerotische plaques ontwikkelen van vettige strepen, over het algemeen aanwezig op sites van lage oscillerende bloedstroom in middelgrote tot grote arteriën, waar gedeponeerde lipide bijdraagt tot activering van het endotheel en een gelokaliseerde ontsteking1. Monocyten worden gerekruteerd voor endotheliale cellen in vettige strepen via monocyt Chemotactische eiwitten (zoals CCL2) en transmigrate in de intima-2. Naar aanleiding van zielsverhuizing, kunnen monocyten uitmaken atherogene, lipide-beladen macrofagen oftewel schuim cellen ten gevolge van lipide opname, lipide synthese, down-regulatie van cholesterol efflux of een combinatie van bovengenoemde factoren. Monocyten kunnen ook accumuleren lipiden in het verkeer en hebben een 'schuimend' fenotype, eventueel predisponerende cellen voor schuim-cel formatie3,4. Schuim cellen zijn de definiërende eigenschap van vettige strepen en beginnende atherosclerotische plaques en hun vorming wordt beïnvloed door zowel lipide en inflammatoire mediatoren5. Als alternatief, monocyten hebben de mogelijkheid om reverse transmigrate van de slagader in de bloedbaan6, daardoor verwijderend lipide van de intima en handelen om de gezondheid van de slagader.
Bepaling van de neiging van monocyten naar transmigrate over arteriële endotheel en formulier schuim cellen in de intima, of om te keren transmigrate en voeren lipide uit de plaque, is een basisvereiste voor het begrijpen van de rol van monocyt activering in toenemende atherosclerotische risico. Muismodellen voor CADs zoals atherosclerose zijn belangrijk in het ophelderen van real-time in vivo informatie over vette streep/atherosclerotische plaque ontwikkeling. Echter, deze modellen vereisen een genetische verandering van de natuurlijke cholesterol verwerking capaciteiten van deze dieren meestal in combinatie met drastische veranderingen in het dieet (zoals het ApoE-/-Western-type dieet model)7,8, daardoor, inducerende niet-fysiologische accumulatie van circulerende lipide niveaus welke schijf plaque ontwikkeling. Deze modellen bieden slechts beperkte relevantie voor chronische inflammatoire menselijke aandoeningen zoals HIV-infectie die niet geassocieerd met verhoogd circuleert cholesterol of low-density lipoprotein (LDL) niveaus. Bovendien verschillen in monocyt biologie tussen mensen en muizen maken het testen van immunologische vragen met betrekking tot de relevantie van de subpopulaties van monocyten (zoals tussenliggende monocyten (CD14++CD16+))9 moeilijk. Dit is belangrijk bij de studie van de mechanismen die rijden van hart-en vaatziekten, zoals de graven van de tussenliggende monocyt onafhankelijk cardiovasculaire gebeurtenissen10,11 voorspellen. Hoewel testen bestaan voor het sequentieel meten van beide monocyt transmigratie of schuim celvorming in isolatie, is geen in vitro -assay gevalideerd voor het kwantificeren van beide aspecten van vroege atherogenese met behulp van dezelfde cellen van klinische cohorten. Transwell modellen gebruiken een gemodificeerde Boyden twee-kamer systeem waarbij cellen worden geladen in de bovenste kamer en transmigrate over een cel enkelgelaagde of poreuze plastic barrière in een tweede kamer die meestal media met chemoattractant12 bevat , 13. terwijl op grote schaal gebruikt voor het analyseren van leukocyten zielsverhuizing, deze modellen een laag vertegenwoordigen de intima, resulterend in transmigrated cellen migreren naar oplossing, in het algemeen niet te nemen en niet toegestaan voor de meting van schuim cel vorming of omgekeerde transmigratie van dezelfde cellen. Daarentegen modellen van de celvorming schuim geen rekening met eventuele transmigratory-geïnduceerde veranderingen monocyten of effecten van endothelial activering waarvan bekend is dat de bijdragen aan het schuim cel formatie14. Bovendien, deze systemen veroorzaken schuim celvorming van macrofagen aangehangen door de toevoeging van het verzadigen van de concentraties van exogene geoxideerde low-density lipoprotein (oxLDL)15,16, een belangrijke inductor cel cultuur platen van schuim celvorming. LDL gebruikt in deze modellen is vaak geoxideerd door niet-fysiologisch-relevante processen zoals CuSO4 behandeling17, daarom vraagtekens bij het fysiologisch belang van studies met behulp van deze modellen.
Hier beschrijven we een bepaling die kwantificeert monocyt zielsverhuizing en celvorming schuim van dezelfde cellen die vereist niet de toevoeging van exogene oxLDL, dus beter de modellering van de rol van monocyten in schuim celvorming. Dit model werd oorspronkelijk ontwikkeld door Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18, en heeft zijn verder verfijnd in ons laboratorium te beoordelen ex vivo de atherogenicity van monocyten geïsoleerd onder niet-activeren voorwaarden van individuen met onderliggende inflammatoire voorwaarden begeleidende ziekten zoals HIV infectie19 evenals vergrijzing20, die zijn geassocieerd met een verhoogd risico van atherosclerose. Dit model biedt ook een platform voor het beantwoorden van elementaire biologische vragen over de neiging van verschillende monocyt deelverzamelingen formulier schuim cellen20, de invloed van endothelial activering door cytokines zoals TNF op schuim celvorming14 , de trekkende eigenschappen van monocyten zoals de diepte en snelheid van de zielsverhuizing in gels19. Bovendien, monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming kan worden gekwantificeerd aan de hand van standaard microscopie, live cel imaging, stroom cytometry en imaging stroom cytometry, daarom bieden een veelzijdige methode om te evalueren van de rol van monocyten in atherogenese.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1187">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Gel preparation reagents</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-500G</td>
			<td>0.1 M NaOH diluted in H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">10X M199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">M0650</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">AcCOOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092-100ML</td>
			<td>20 mM Acetic acid diluted in H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cultrex Bovine Collagen I</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3442-050-01</td>
			<td>Type I Fibrous Collagen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M199</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11150-059</td>
			<td style="width:595px;">M199 media containing Earle&#39;s salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. 
			Media supplemented with 100 &#181;g/mL L-glutamine&#160; and 100 U/mL penicillin/streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. 
			Individual lipid species such as LDL can be added to M199.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">HUVEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human coronary artery endothelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>BDH Merck</td>
			<td>10093.5V</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-500G</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 &#181;g/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">New born calf serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">16010-142</td>
			<td style="width:595px;">New born calf serum: New Zealand origin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056-1MG</td>
			<td>Fibronectin - 50 &#181;g/mL aliquots prepared and stored</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">PBS (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1% TNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015</td>
			<td>Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 &#181;g/mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-density lipoprotein</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>LP2-2MG</td>
			<td>Low-density lipoprotein (LDL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscopy</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1 or 2% formaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>4018</td>
			<td>1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50% and 78% methanol</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>318-2.5L GL</td>
			<td>50% or 78% v/v methanol, diluted with H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil Red O stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>Mikro-Glass</td>
			<td>S41104AMK</td>
			<td style="width:595px;">Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slips</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>MENCS224015GP</td>
			<td>22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double-sided tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>4011</td>
			<td>Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Giemsa stain</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.09204.0500</td>
			<td>Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hole punch</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;">Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flow cytometry</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 &#181;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34959</td>
			<td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">FACS wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plasticware</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>167008</td>
			<td>Delta surface flat-bottomed 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 cm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Sterile 10 cm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>Eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer pipette</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>222-20S</td>
			<td>Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte transmigration and foam cell formation from individuals with chronic inflammatory conditions

Coronaire hartziekten (CAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Atherosclerose, een toonaangevende veroorzaken van CAD-, wordt geïnitieerd door de transmigratie van aangeboren immuun monocyten naar inflammatoire sites van gedeponeerde lipide vettige strepen, die aanwezig in arteriële muren van medium tot grote arteriën zijn genoemd. De pathogene spil van laesies in dit vroege stadium van atherosclerose is de rijping van monocyten die naar slagaders migreren om schuim cellen of lipide-beladen macrofagen. Aanzienlijke bewijs ondersteunt de hypothese dat risico van atherosclerose wordt verhoogd met chronische inflammatoire aandoeningen begeleidende ziekten zoals reumatoïde artritis en HIV, evenals algemene vergrijzing, en dat dit risico wordt voorspeld door monocyt activering. Hoewel Muismodellen een goed platform bieden voor het onderzoek naar de rol van monocyten in atherogenese in vivo, ze genetische wijziging van natuurlijke cholesterol metabolisme en drastische wijziging van normale muis diëten vereisen, en hebben beperkte geschiktheid voor de studie van atherogene invloeden van menselijke comorbide aandoeningen. Dit motiveerde ons om een menselijke in vitro model voor het meten van het atherogene potentieel van monocyten geïsoleerd uit personen met een bepaalde ziekte staten te ontwikkelen. Op dit moment beperken menselijke in vitro modellen in die zin dat zij monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming in isolatie evalueren. Hier beschrijven we een protocol waarin monocyten geïsoleerd uit patiënt bloed transmigrate over menselijke endotheliale cellen in een matrix van de collageen type 1 en hun neiging om te rijpen in schuim cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van exogene lipide wordt gemeten. Het protocol is gevalideerd voor het gebruik van menselijke monocyten gezuiverd van personen met HIV-infectie en ouderen HIV niet geïnfecteerde individuen. Dit model is veelzijdig en kunt monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming te worden geëvalueerd met behulp van beide microscopie of stroom cytometry evenals waardoor de beoordelingvan atherogene factoren in serum of plasma.

Kwantificeren van monocyt zielsverhuizing
Monocyten worden toegevoegd aan het model zoals beschreven in Figuur 1en zes gels zijn bereid voor elke voorwaarde. Monocyten voor 6 gels per donor (dat wil zeggen, 5.0 x 104 monocyten per gel 6 gels = 3.0 x 105 monocyten per donor) geresuspendeerde zijn tot een eindvolume van 600 µL van M199 media met de lipi...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions at JoVE.com

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Beschrijven we een protocol voor het meten van transmigratie door monocyten over menselijke endothelial monolayers en hun daaropvolgende rijping in schuim cellen. Dit biedt een veelzijdige methode te beoordelen van de atherogene eigenschappen van monocyten geïsoleerd uit mensen met verschillende ziekten en te evalueren van factoren in het bloed die deze neiging kunnen versterken.

Kwantificering van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van personen met chronische inflammatoire aandoeningen

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Kwantificering van monocyten Chemotactische activiteit in vivo en karakterisering van bloed monocyten afgeleide macrofagen

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Scheiding van rat epidermis en dermis met thermolysine om site-specifieke inflammatoire mRNA en eiwit te detecteren

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...