Name: quantification of monocyte transmigration and foam cell formation from individuals with chronic inflammatory conditions
Uploaded: 2017-10-17T12:30:00
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저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 교수 윌리엄 뮬러 박사 클레어 Westhorpe의 작품을 인정합니다. 저자 또한 monocyte의 정렬에 대 한 AMREP Flow Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다 하위 집합 및 알프레드 병원 감염 질병 단위 임상 연구 일부 연구에 대 한 HIV + 개인의 채용에 대 한 간호사. 저자는 기꺼이 버넷 연구소를 받은 빅토리아 운영 인프라 지원 프로그램의이 작품에 기여를 인정 합니다. TAA는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 NHMRC 프로젝트 그랜트가 아에 게 수 여 하는 1108792에 의해 지원 되었다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # UL1TR000124.

참고: 인간의 생물 학적 샘플을 사용 하 여 모든 실험 윤리 승인 알프레드 병원 인간의 윤리 위원회, 멜버른에서에서 수행 되었습니다. 지정 하지 않으면 모든 실험은 클래스 II Biosafety 캐비닛에 수행 했다. &#34; Prewarmed &#34;는 waterbath에서 37 ° C로 예 열 하는 약을 말합니다.
 1. 준비의 유형 I 섬유 콜라겐 젤: 1 일 <ol><li>준비 순차적으로 추가 하 고 혼합 35.7 m m NaOH에 의해 콜라?...

<ol>
	<li>Napoli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+streak+formation+occurs+in+human+fetal+aortas+and+is+greatly+enhanced+by+maternal+hypercholesterolemia.+Intimal+accumulation+of+low+density+lipoprotein+and+its+oxidation+precede+monocyte+recruitment+into+early+atherosclerotic+lesions.">Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).</li><li>Woollard, K. J., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+in+atherosclerosis:+subsets+and+functions.">Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.</a> Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foamy+Monocytes+Form+Early+and+Contribute+to+Nascent+Atherosclerosis+in+Mice+With+Hypercholesterolemia.">Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).</li><li>Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very-low+and+low-density+lipoproteins+induce+neutral+lipid+accumulation+and+impair+migration+in+monocyte+subsets.">Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets.</a> Scientific Reports. 6, 20038 (2016).</li><li>Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+foam+cell+formation+in+chronic+inflammatory+disease.">Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease.</a> Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).</li><li>Llodr&#225;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emigration+of+monocyte-derived+cells+from+atherosclerotic+lesions+characterizes+regressive,+but+not+progressive,+plaques.">Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atherosclerosis.">Animal Models of Atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).</li><li>Meir, K. S., Leitersdorf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+in+the+Apolipoprotein+E-Deficient+Mouse.+A+Decade+of+Progress.">Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).</li><li>Hilgendorf, I., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+difference:+Monocyte+Heterogeneity+in+Cardiovascular+Disease.">Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease.</a> Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+Apo+A-I+and+Lower+HDL-C+Levels+Are+Associated+With+Higher+Intermediate+CD14++CD16++Monocyte+Counts+That+Predict+Cardiovascular+Events+in+Chronic+Kidney+Disease.">Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++Monocytes+Independently+Predict+Cardiovascular+Events:+A+Cohort+Study+of+951+Patients+Referred+for+Elective+Coronary+Angiography.">CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chemotactic+Effect+Of+Mixtures+Of+Antibody+And+Antigen+On+Polymorphonuclear+Leucocytes.">The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+activation+promotes+foam+cell+formation+by+monocytes+following+transendothelial+migration+in+an+in+vitro+model.">Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model.</a> Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).</li><li>Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+modified+low+density+lipoproteins:+a+potential+role+in+recruitment+and+retention+of+monocyte/macrophages+during+atherogenesis.">Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).</li><li>Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+macrophage+degradation+of+biologically+modified+low+density+lipoprotein.">Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).</li><li>Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+Low-Density+Lipoprotein.">Oxidized Low-Density Lipoprotein.</a> Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).</li><li>Muller, W. A., Weigl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-selective+transendothelial+migration:+dissection+of+the+binding+and+transmigration+phases+by+an+in+vitro+assay.">Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay.</a> J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).</li><li>Maisa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+from+HIV-infected+individuals+show+impaired+cholesterol+efflux+and+increased+foam+cell+formation+after+transendothelial+migration.">Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration.</a> AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).</li><li>Angelovich, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+foam+cell+formation+is+enhanced+in+monocytes+from+older+individuals+by+both+extrinsic+and+intrinsic+mechanisms.">Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms.</a> Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).</li><li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HIV-1+infection+in+vitro+on+transendothelial+migration+by+monocytes+and+monocyte-derived+macrophages.">Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages.</a> J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).</li><li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current.">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).</li><li>M&#252;ller, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Endothelial+Markers+PECAM-1,+vWf,+and+CD34+in+Vivo+and+in+Vitro.">Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro.</a> Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).</li><li>Kelesidis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+impaired+HDL+function+in+HIV-1+infected+compared+to+uninfected+individuals.">Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Gacka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+and+atherogenic+activity+of+monocytes+in+Type+2+diabetes.">Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes.</a> J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+and+cardiovascular+outcome+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease.</a> Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).</li></ol>

여기에 설명 된 프로토콜 monocyte 환생 및 거품 세포 형성을 결합 하 여 인간의 임상 동료에서 monocytes의 atherogenicity를 평가 하기 위한 다양 하 고 생리 적으로 관련 된 방법을 제공 합니다. 이 모델은 거품 세포 형성에 monocyte 환생의 효과 고려 하 고 이외에 고유의 역 환생6 의 측정을 허용 한다 거품 세포 형성의 다른 방법을 통해 장점을 제공합니다 버 외 인 요인의 존재 여부에 거?...

Monocyte 환생은 혈전 증, 뇌졸중과 심근 경색으로 이어질 수 있는 동맥 경 화성 플 라크의 개발에 중요 한 단계 이다. 동맥 경 화성 플 라크 지방 줄무늬, 일반적으로 현재의 낮은 진동 혈액 흐름의 사이트에서 중간에 큰 동맥, 예금 된 지질 내 피 활성화에 기여 하 고 염증1지역화에에서 개발. Monocytes는 monocyte 혈 단백질 (CCL2) 등을 통해 지방 줄무늬에 내 피 세포를 보충 하 고 intima2로 transmigrate. 환생, 다음 monocytes 지질 통풍 관, 지질 합성, 콜레스테롤 경과의 다운 레 귤 레이 션 또는 위 요인의 조합 결과로 거품 세포 라고 하는 atherogenic, 지질-라덴 세포 형성 수 있습니다. Monocytes 또한 순환에 있는 지질 축적 하 고 아마도 predisposing 세포 거품 세포 형성3,4에 대 한 '거품' 표현 형을가지고 수 있습니다. 거품 세포는 지방 줄무늬와 초기 단계의 동맥 경 화성 플 라크의 정의 기능 그리고 그들의 대형은 지질과 염증 성 중재자5에 의해 영향을. 또는, monocytes는 반대로 수 동맥에서 혈 류6, intima 동맥의 건강을 유지 하는 행동에서 지질 제거로 transmigrate.
하는 monocytes의 성향을 결정 동맥 내 피에 걸쳐 transmigrate 및 양식 폼 셀은 intima에 또는 반대로 transmigrate 그리고 플 라크에서 지질, 증가에 monocyte 활성화의 역할을 이해 하기 위한 주요 요구 사항 동맥 경 화성 위험입니다. 동맥 경화 증 마우스 모델 CADs의 지방 조 흔/동맥 경 화성 플 라크 개발에 대 한 정보 실시간 vivo에서 elucidating에 중요 하다. 그러나, 이러한 모델 (ApoE-/-서 부 타입 다이어트 모델) 등 다이어트7,8, 과감 한 변경와 일반적으로 결합 하는, 이러한 동물의 능력을 처리 하는 자연 콜레스테롤의 유전 변경 필요 어떤 드라이브 패 개발을 레벨 지질 순환의 비 생리 적 축적을 유도 합니다. 이러한 모델 만성 염증 성 인간의 조건 HIV 감염 등 콜레스테롤 저밀도 지단백 (LDL) 수치를 순환 증가와 연결 되지 않은 관련을 제한 수 있습니다. 또한, 차이 monocyte 생물학 인간과 쥐 monocytes의 부분 모집단의 관련성에 대 한 면역 질문 테스트 확인 (등 중간 monocytes (CD14+CD16 ++))9 어려운. 이 때 중요 한 심혈 관 질환으로 중간 monocyte 건의 심장 혈관 사건의10,11를 독립적으로 예측 운전 메커니즘을 공부. 분석 실험 순차적으로 격리에서 하거나 monocyte 환생 또는 거품 세포 형성을 측정 하기 위해 존재, 임상 동료에서 동일한 셀을 사용 하 여 초기 atherogenesis의 두 측면을 측정을 위한 생체 외에서 시험 검증 않았습니다. Transwell 모델에 의하여 셀 상단 챔버로 로드 되 고 다공성 플라스틱 방 벽 또는 셀 단층으로 일반적으로 chemoattractant12 미디어를 포함 하는 낮은 챔버 transmigrate 수정된 Boyden 2 챔버 시스템을 활용 , 13. 백혈구 환생의 분석을 위해 널리 이용 된다, 하는 동안 이러한 일반적으로 intima, 솔루션으로 마이그레이션 transmigrated 셀에 결과 나타내는 레이어를 포함 하지 않는 모델과 거품 세포의 측정에 대 한 허용 하지 않습니다 형성 또는 동일한 셀의 반전 환생입니다. 반대로, 거품 세포 형성의 모델 monocytes 또는 거품 세포 형성14을 알려져 있다 내 피 활성화의 효과를 유도 transmigratory 변경에 대 한 계정을 하지 않습니다. 또한, 이러한 시스템 유도 거품 세포 형성 세포에서 세포 배양 배지 exogenous 산화 저밀도 지 단백질 (oxLDL)15,16, 키 유도의 농도 포화의 추가 의해 준수 거품 세포 형성. LDL이이 모델에 사용 되는 종종 산화 CuSO4 치료17, 같은 비-순수-관련 프로세스에 따라서, 이러한 모델을 사용 하 여 연구의 생리 적인 중요성을 심문.
여기 우리가 따라서 거품 세포 형성에 monocytes의 역할을 잘 모델링 monocyte 환생과 외 인 oxLDL의 추가 요구 하지 않는 동일한 세포의 거품 세포 형성을 단정 하는 분석 결과 설명 합니다. 이 교수 윌리엄 뮬러 (노스웨스턴 대학교, 시카고)18에 의해 원래 개발 되었다 모델과 비보 전 비 활성화에서 격리 하는 monocytes의 atherogenicity 평가 하기 위해 우리의 실험실에 더 세련 된 개인 기본 염증 성 조건20노화 뿐만 아니라 HIV 감염19 질병을 동반, 그 조건은 동맥 경화 증의 위험 증가와 관련. 이 모델 또한 폼 거품 세포20, 거품 세포 형성14에 TNF 같은 cytokines에 의해 내 피 활성화의 영향을 다른 monocyte 하위 집합의 성향에 관한 기본적인 생물학 질문에 응답 하기 위한 플랫폼을 제공 합니다. , 깊이 등 monocytes의 철새 속성과 젤19에 환생의 속도 및. 또한, monocyte 환생 및 거품 세포 형성 표준 현미경을 사용 하 여 측정할 수 있습니다, 그리고 라이브 셀 이미징, flow cytometry 및 이미징 cytometry, 따라서, atherogenesis에 monocytes의 역할을 평가 하는 다양 한 방법을 제공.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1187">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Gel preparation reagents</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465-500G</td>
			<td>0.1 M NaOH diluted in H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">10X M199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">M0650</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">AcCOOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092-100ML</td>
			<td>20 mM Acetic acid diluted in H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cultrex Bovine Collagen I</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3442-050-01</td>
			<td>Type I Fibrous Collagen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M199</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11150-059</td>
			<td style="width:595px;">M199 media containing Earle&#39;s salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. 
			Media supplemented with 100 &#181;g/mL L-glutamine&#160; and 100 U/mL penicillin/streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. 
			Individual lipid species such as LDL can be added to M199.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">HUVEC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human coronary artery endothelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:595px;">Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>BDH Merck</td>
			<td>10093.5V</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-500G</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 &#181;g/mL Streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">New born calf serum</td>
			<td style="width:128px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">16010-142</td>
			<td style="width:595px;">New born calf serum: New Zealand origin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056-1MG</td>
			<td>Fibronectin - 50 &#181;g/mL aliquots prepared and stored</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">PBS (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1% TNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015</td>
			<td>Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 &#181;g/mL aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-density lipoprotein</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>LP2-2MG</td>
			<td>Low-density lipoprotein (LDL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microscopy</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">1 or 2% formaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>4018</td>
			<td>1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50% and 78% methanol</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>318-2.5L GL</td>
			<td>50% or 78% v/v methanol, diluted with H20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil Red O stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625-25G</td>
			<td>Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>Mikro-Glass</td>
			<td>S41104AMK</td>
			<td style="width:595px;">Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slips</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>MENCS224015GP</td>
			<td>22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double-sided tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>4011</td>
			<td>Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Giemsa stain</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.09204.0500</td>
			<td>Giemsa&#39;s azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Hole punch</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;">Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Flow cytometry</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 &#181;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34959</td>
			<td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">FACS wash</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Plasticware</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate</td>
			<td>Nunclon</td>
			<td>167008</td>
			<td>Delta surface flat-bottomed 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 cm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Sterile 10 cm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>Eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer pipette</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>222-20S</td>
			<td>Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of monocyte transmigration and foam cell formation from individuals with chronic inflammatory conditions

관상 동맥 질환 (CAD)는 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인입니다. 동맥 경화, 선도적인 CAD의 원인, 예금 된 지질 이라는 큰 동맥에 동맥 벽의 중간에 있는 지방 줄무늬의 염증 성 사이트에 타고 난 면역 monocytes의 환생에 의해 시작 됩니다. 병 변은 동맥 경화 증의 초기 단계에서의 주요 병원 성 특징은 거품 세포 또는 세포 지질 라덴 형태로 동맥으로 마이그레이션하는 monocytes의 성숙 이다. 상당한 증거 지원 일반적인 노화 뿐 아니라 류 마티스 관절염 및 HIV, 질병을 동반 하는 만성 염증 성 조건에 의해 동맥 경화 증의 위험이 증가 하 고이 위험 monocyte에 의해 예측 가설 활성화입니다. 마우스 모델 vivo에서atherogenesis에 monocytes의 역할을 조사 하는 좋은 플랫폼을 제공, 그들은 자연 콜레스테롤 물질 대사의 유전 변경 및 일반 마우스 다이어트의 과감 한 변경 요구 및 적합성에 대 한 제한 인간의 comorbid 질병의 atherogenic 영향 연구. 이 모델을 인간의 생체 외에서 정의 된 질병 국가와 개인 으로부터 격리 하는 monocytes의 atherogenic 잠재력 측정을 개발 동기. 현재, 인간의 생체 외에서 모델은 격리에 monocyte 환생 및 거품 세포 형성 평가을 제한 하 고 있다. 여기 우리는 프로토콜 설명 monocytes 환자의 혈액에서 분리 된 1 형 콜라겐 매트릭스로 인간의 내 피 세포에서 transmigrate 그리고 그들의 성향 외 인 지질의 유무에 거품 세포로 성숙 하는 측정. 프로토콜에서 HIV 감염을 가진 개인 및 노인 HIV 감염 되지 않은 개인 정화 인간 monocytes의 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 모델은 다목적 monocyte 환생과 거품 세포 형성 중 현미경을 사용 하 여 계산 될 수 있습니다 또는 atherogenic 요인의 평가 허용 뿐만 아니라 cytometry 혈 청 또는 혈장에 존재.

Monocyte 환생을 측정
Monocytes는 그림 1에 설명 된 대로 모델에 추가 되 고 6 젤 각 조건에 대 한 준비가. Monocytes 기증자 당 6 젤에 대 한 (즉, 젤 6 젤 당 104 monocytes x 5.0 = 기부자 당 105 monocytes x 3.0) 포함 하는 필요한 혈 청/절연 지질 M199 미디어의 600 µ L의 최종 볼륨을 resuspende...

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Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

우리 인간의 내 피 monolayers에 걸쳐 monocytes에 의해 환생 및 거품 세포로 그들의 후속 성숙 측정 프로토콜을 설명 합니다. 이 혈액이 경향이 향상 시킬 수 있는 요인을 평가 하 고 다른 질병 조건 가진 사람에서 격리 하는 monocytes의 atherogenic 속성을 평가 하기 위해 다양 한 메서드를 제공 합니다.

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

연구

면역학 및 감염병학

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

부위별 염증성 mRNA 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...