Name: biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092 at JoVE.com

ونعترف أوبف-المملكة المتحدة لتقديم المساعدة في مجال الاستنساخ، "هاريس جيما" مولات ثانية والعلماء من بيملينيس I03 و I04 في "الماس مصدر الضوء".

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في هذه الورقة، ونحن تصف والتحقق من صحة بروتوكولا متكاملة لتوصيف البيوكيميائية والهيكلية من الكربوهيدرات سببس مع تركيز بشكل خاص على البروتينات من س. الرئوية. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا كإجراء موحد لتحليل سببس أخرى من الكائنات المختلفة وحتى البروتينات القابلة للذوبان أخرى لا علاقة لها.
الجزء الأول من البروتوكول يركز على توفير المعلومات البيوكيميائية على الاستقرار البروتين وهيكل رباعي، التي يمكن استغلالها في إعداد عينات البروتين لبلورة. في المقطع فحوصات التحول الحراري، يصف لنا فقط على درجة الحموضة وتغيرات تركيز كلوريد الصوديوم للحفاظ على الطابع العام لهذا الإجراء. وعلى الرغم من ذلك، العديد من الشروط الأخرى في المخزن المؤقت يمكن اختبارها بطريقة مشابهة، على سبيل المثال، بما في ذلك أي مجمع الكيميائية المستخدمة كمادة مضافة استقرار: خاصة ligand(s) الفعلية التي تربط الاستراتيجية والخطة الاستشرافية محددة فعالة بشكل ملحوظ في زيادة تم ببضع درجات مئوية31. وفي بعض الحالات، يمكن تعريف منحنيات يشوه سيئة بسبب إشارة منخفضة أو خلفية فلورية عالية، الذي يحدث بسبب تراكم البروتين أو تتكشف جزئيا. لتجنب هذا الأمر، يمكن أن يؤديها معايرة بروتين: صبغ لتحسين المنحنيات يشوه غير واضحة. إذا تم الحصول على أي تحسن، ينصح بفحص المضافات المختلفة التي يمكن تحسين استقرار البروتين، وشاشات مناسبة تم وصفه سابقا54.
بشكل عام، سببس معظم أحادي في بيئتهم الطبيعية، ولكن كما هو موضح هنا مولتيميريزيشن يمكن أن تحدث في تركيزات أعلى تستخدم في تجارب التبلور، وبالتالي توصيف السلوك أوليجوميريزاتيون التي تقدمها مالس وثانية أساسية لتقييم حالة أوليجوميريزيشن مونوديسبيرسي مستقرة مواتية أكثر لبلورة. ومع ذلك، من الصعب التنبؤ بتأثير مختلف المواد الكيميائية المدرجة في حالة تبلور على السلوك أوليجوميريزيشن من البروتينات. إذا تبين دراسة ثانية ومالس تجميع واسعة من العينة البروتين، سوف ننصح التالية للحد من احتمال حدوث هذا الأمر: استخدام عينة جديدة من البروتين (عدم تجميد مذاب) وتوسيع نطاق التحليل استقرار أداء مع الحرارية تحول فحوصات، اختبار المواد المضافة المحتملة والمنظفات معتدل كمورد آخر، للحد من التراكم. في هذه الورقة، نقدم المبادئ التوجيهية الأساسية لبلورة استخدام مصفوفة متناثر الفائق التجاري تبلور الفرز للحفاظ على الطابع العام لهذا البروتوكول. ومع ذلك، الحصول على بلورات البروتين حيود الأشعة السينية ذات الدقة العالية قد تحتاج إلى ضبط تكراري لتحسين ظروف التبلور فيما يتعلق بتركيز مرسب، الرقم الهيدروجيني، وإضافة المواد الكيميائية المضافة، درجات حرارة مختلفة، و عوامل أخرى تغير ديناميات توازن بين كريستال الخزان وإسقاط16،17.
ويصف الجزء الثاني من البروتوكول توصيف بلورات البروتين بغية تحديد الاستراتيجية المثلى لجمع البيانات حيود الأشعة السينية مع تركيز بشكل خاص على الحصول على البيانات الشاذة لمراحل الحزن. حتى لو سببس الحفاظ على بنية عامة مماثلة (وهناك العديد من الهياكل 3D المودعة يحتمل أن تكون صالحة للاستعمال كبداية النماذج)، التخلص التدريجي من هذه البروتينات بطريقة الاستبدال الجزيئي ليست دائماً واضحة بسبب التباين عناصر البنية الثانوية والمرونة المتأصلة في هذه البروتينات. ومن ثم اقتراح أسلوب حزين، وتسليط الضوء على أن هذه البروتينات قد يكون جوهريا منضم بالفعل المعادن أو ملزمة في الواقع غير محددة من المعادن من ظروف التبلور المخزن المؤقت، التي يمكن أن توفر مجموعة من العناصر ديفراكتينج الشاذة الخطوة القياسية في البروتوكول العام أعمالنا.
وفي الختام، يعرف هذا البروتوكول سير عمل إرشادية قياسية للإجراءات التي تتيح لوصف مفصل لميزات سببس التي يمكن استغلالها لزيادة معدل نجاح تصميم الهيكل، فضلا عن الإسراع في الكيمياء الحيوية والهيكلية وصف سببس الهيكلية بصورة عامة.

س. الرئوية (بنيوموكوككوس) بكتيريا إيجابية المقيمين أعراض في الخطوط الجوية العليا من الجهاز التنفسي البشرية مع القدرة على الهجرة إلى منافذ عقيمة عادة يسبب التهاب الإذن، الالتهاب الرئوي، وتعفن الدم، تسمم الدم، و التهاب السحايا،من12. وعلاوة على ذلك، هو عدوى المكوّرات الرئوية السبب الرئيسي للالتهاب الرئوي المجتمع المكتسبة، مما يسهم في أعباء الاقتصادية والطبية في جميع أنحاء العالم3،4. سلالات مقاومة للمضادات الحيوية من س. الرئوية قد انتشرت في جميع أنحاء العالم، وعلى الرغم من أن ساعدت سبعة-بالينت وثلاثة عشر-بالينت بروتين المكوّرات الرئوية المتقارنة لقاح خفض معدل مقاومة مضادات الميكروبات، استبدال سلالات من وقد برزت استخدام اللقاحات قد أدت إلى ازدياد الطلب على البحث في تطوير علاجات جديدة لمرض المكوّرات الرئوية5،6،،من78.
بنيوموكوككوس يعتمد على السكر المستوردة من البلد المضيف ك9،الكربون مصدر10؛ والواقع أنه يكرس 30% أجهزتها استيراد لنقل 32 الكربوهيدرات مختلفة11،،من1213. وتشمل هذه المستوردين ABC-الناقلون ثمانية على الأقل13. في أي بي سي الناقلين، سببس خارج الخلية تلعب دوراً أساسيا في تحديد الخصوصية ليجند وتقديمه إلى الناقل غشاء لا يتجزأ لامتصاص في الخلية. سببس تمثل أهدافا صالحة لتصميم لقاحات جديدة ومضادات لأنهم البروتينات السطحية ودورها الحيوي في العمليات الخلوية.
توصيف البروتين المستهدف ووصف مفصل للسمات الهيكلية، مثل جيوب يجند والمرونة بين المجالات، توفر أداة مفيدة للمخدرات على أساس هيكل تصميم14،15. علم البلورات بالأشعة السينية هو الأسلوب المفضل لتوصيف الهيكلية للبروتينات في القرب من القرار الذري، ولكن عملية تبلور لا يمكن التنبؤ بها، وتستغرق وقتاً طويلاً، ولم تكن ناجحة دائماً. وتحسنت أساليب منهجية معدل النجاح وهي عوامل هامة نوعية العينة والاستقرار. ويتأثر معدل نجاح تبلور البروتين الخصائص الكيميائية ومنهجية إعداد عينة. ويمكن تقييم أثر هذه وأبلغ بتوصيف البيوكيميائية16،17.
مضاعفات أخرى لتصميم الهيكل القائم هو المشكلة بلورية المرحلة التي يجب معالجتها. كما أصبحت أكثر البروتين الهياكل المتوفرة، يمكن حل العديد من الهياكل بطريقة استبدال الجزيئية، الأمر الذي يتطلب هيكل مثلى18. كما سببس الراهن بنية مجال مرنة، استبدال الجزيئية قد يثبت أيضا تحديا19. إذا لم يتوفر نموذج هيكلي مشابه بما فيه الكفاية للبروتين المستهدف، يمكن استخدام عدد من التقنيات للحصول على مراحل تجريبية20. ومن بين هذه الأسلوب تشتت الشاذة طول موجي واحد (SAD) برز كتقنية أساسية، وقد استخدمت على نطاق واسع لحل مشكلة المرحلة21. تم استخدام أسلوب حزين قدما مع تحسينات في الأجهزة والبرامج، فضلا عن استراتيجيات جمع البيانات للسماح باكتشاف واستخدام الإشارات الشاذة الضعف التدريجي2322،، 24. وعلاوة على ذلك، التقدم في أساليب مباشرة لحل هياكل الجزيئات الكبرى، التي كانت في الماضي تتطلب البيانات حيود القرار الذري، يمكن الآن استخدامها عن طريق على سبيل المثال، الجمع بين معارف الخبراء بتنفيذها في البرنامج أرسيمولدو25. وتعطي استعراضاً مفيداً لأساليب لحل مشكلة المرحلة في علم البلورات تايلور26.
هنا نقدم بروتوكول ترشيدا لتوصيف الكربوهيدرات النقل الاستراتيجية والخطة الاستشرافية، SP0092 س. الرئوية، إدماج تقنيات الكيمياء الحيوية والهيكلية (الشكل 1). يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة حالة اختبار مثالاً مفيداً لاستراتيجيات لتحسين معدل نجاح دراسات الهيكلية في سببس بشكل عام، التي توجد في جميع الممالك من الحياة. على وجه الخصوص، البروتوكول يبرز أهمية تميز الدولة oligomeric الأكثر استقرارا من البروتين في الحل بطريقة سريعة وفعالة، ويتيح تحديد الأنواع أفضل متابعة لبلورة التجارب. ورغم أن هناك ما يزيد على 500 الهياكل الاستراتيجية والخطة الاستشرافية في "مصرف بيانات البروتين"27، يمكن أن يكون تحديا الاستبدال الجزيئي نظراً لطبيعة المرونة المتأصلة بين المجالات α/β، التي ترتبط ب منطقة مفصلي19. وهكذا يصف الجزء الثاني من البروتوكول استخدام أسلوب حزين للتخلص التدريجي من الأيونات المعدنية ملزمة، وهي مشتركة في سببس، فضلا عن إدراج سيلينوميثيونيني واستخدام السيلينيوم (Se) في مراحل الحزن.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SelenoMethionine Medium Complete</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-500</td>
			<td>Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306737</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems&#174; 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S6651</td>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4362143</td>
			<td>The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN HELEOS II</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td></td>
			<td>DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 5/150 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906561</td>
			<td>Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the &#34;increase&#34; version but this model is ideal for the standard day by day use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well &#34;Big&#34; Sitting Drop Crystallization Plate</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td>The 24 well &#34;big&#34; crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Pre-Crystallization Test</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR2-140</td>
			<td>The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6098xx</td>
			<td>Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td>The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Foam Dewar</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-35</td>
			<td>5.7&#34; diameter by 2.8&#34; deep. 800mL capacity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-955</td>
			<td>Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes&#8482; that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puck dewar loading tool</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td>This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092

تطوير اللقاحات ومضادات جديدة العقدية الرئوية (بنيوموكوككوس) ضرورية لوقف الارتفاع السريع في سلالات مقاومة متعددة. الكربوهيدرات الركازة ملزم البروتينات (سببس) تمثل أهدافا قابلة للاستمرار لتطوير لقاحات القائم على البروتين ومضادات جديدة بسبب تلك الترجمة خارج الخلية والدور المركزي لاستيراد الكربوهيدرات الأيض المكوّرات الرئوية، على التوالي. الموصوفة هنا هو بروتوكول متكامل ترشيد القيام بوصف شامل ل SP0092، التي يمكن أن تمتد إلى سائر الكربوهيدرات سببس من بنيوموكوككوس والبكتيريا الأخرى. هذا الإجراء يمكن أن يساعد تصميم الهيكل القائم لمثبطات لهذه الفئة من البروتينات. عرضت في الجزء الأول من هذه المخطوطة بروتوكولات لتحليل الكيمياء الحيوية بمقايسة التحول الحراري، متعدد زاوية تشتت الضوء (مالس)، وحجم الاستبعاد اللوني (ثانية)، وتحسين الاستقرار وتجانس العينة الموجهة إلى تبلور المحاكمات وذلك يعزز احتمالات النجاح. ويصف الجزء الثاني من هذا الإجراء وصف استخدام بيامليني السنكروتروني حيود شاذة الطول موجي الانضباطي، وبروتوكولات جمع البيانات لقياس البيانات التي يمكن استخدامها لحل البروتين تبلور بلورات الاستراتيجية والخطة الاستشرافية الهيكل.

وقد ثبت هذا البروتوكول المتكامل لتكون ناجحة مع أربعة (اثنان هما المنشورة وهياكل) من الكربوهيدرات ستة أهداف البروتين ملزمة من pneumococcus تحليلها حتى الآن32،53. في هذا القسم، نقدم توصيف SP0092 الكيمياء الحيوية والهيكلية كنتيجة ممثل لتوجيه الدراسات الهيكلية سببس بشكل عام.
بعد قد أعربت عن SP0092 الاستراتيجية والخطة الاستشرافية وتنقيته كما يعرف سابقا32، وقد تم تحليل البروتين المنقي للاستقرار المخزن المؤقت باستخدام مقايسة تحول حراري: SP0092 المعارض زيادة تيم على درجة الحموضة 6.5 وفي وجود كلوريد الصوديوم في 0-0.2 M نطاق التركيز (الشكل 3A). وفي ضوء هذا، كان يعرف الحل المخزن المؤقت للخطوات التالية: 0.2 M 0.02 م مس pH 6.5، كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 2.5% (v/v)، 0.5 مم تسيب. كتلة المولى المطلقة من دول مختلفة أوليجوميريزيشن SP0092 تم قياسه بواسطة مالس بالإضافة إلى ثانية قياس وزن الجزيئي 187.2 و 140.8 97.0 49.4 كاتشين، المطابق للأنواع تيتراميريك، تريميريك، ديميريك، وموحودي، على التوالي ( الشكل 3). وكشف تحليل للشخصية ثانية في تخفيف البروتينات المختلفة أن أوليجوميريزيشن يتم تشغيلها بواسطة تركيز زيادة البروتين، مما يوحي بأن ليغومرات أكبر أكثر استقرارا في تركيزات أعلى مما يستخدم عادة في تبلور. وفي الواقع، الأنواع oligomeric أكبر المنقي الموجهة إلى بلورة المحاكمات، بلورات البروتين المنتجة بنجاح حين مونومر الأنواع لم.
محسن البلورات التي تم الحصول عليها من الأم وسراج الدين-الميثيونين المسمى أشكال SP0092 اتسمت حيود الأشعة السينية. وكشف قياس fluorescence الأشعة السينية من هذه البلورات في كلتا الحالتين قمم الانبعاثات للزنك ملزمة للبروتين، في حين تم الكشف عن سراج الدين فقط لبلورات الميثيونين سراج الدين كما هو متوقع. في وقت لاحق، أجريت فحص امتصاص الأشعة السينية عند حواف سراج الدين والزنك، التي وفرت بيانات تجريبية مباشرة لضبط طول موجه الأشعة السينية الحادث إلى حواف امتصاص الأشعة السينية كل منها الزنك أو سراج الدين الموجودين في البلورات تكبير الإشارات الشاذة يمكن الحصول عليها من البيانات الناتجة عن ذلك (الشكل 4A–ب).
وبعد قياس ثلاثة أنماط الحيود في انتقال العدوى منخفض، تم الحصول على مجموعة كاملة من البيانات شاذة استخدام استراتيجية جمع البيانات اقترحها إدنا (الشكل 4). مشغلات الإشارات الشاذة هذا الأنبوب مراحل الآلي في بيمليني لتحديد البنية الفرعية، واستنادا إلى المراحل التجريبية الأولية المشتقة، تنتج الأولى الخرائط والنماذج التي يمكن صقلها والتحقق من صحتها (الرقم 4 ).
وباختصار، يتم توسيط المزالق المحتملة لهذه التقنية أساسا على توافر كريستال والجودة. الاستغلال الأمثل للظروف المخزن المؤقت لتحسين الاستقرار البروتين، فضلا عن تحديد الدولة oligomeric أنسب من البروتين لاستخدام، وعندما يتم تحديد أوليجومير واحد أو أكثر في الحل، يمكن أن تقلل من خطر الفشل في بلورة المرحلة. استغلال استخدام أيونات المعادن المرتبطة التي تم تحديدها في مرحلة مبكرة يمكن تسريع بنية الحل وتجنب الإنتاج غير الضروري للمسمى البروتين عندما تفشل أساليب استبدال الجزيئية selenomethionine.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
رقم 1. رسم تخطيطي لسير العمل لتحديد الخصائص الكيميائية الحيوية والهيكلية من الكربوهيدرات سببس. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
رقم 2. توصيف كريستال في GDA. (أ) لقطة من علامة التبويب التحكم fluorescence الأشعة السينية لبرامج التحكم بيمليني GDA. (ب) لقطة من علامة التبويب التحكم الحافة--تفحص الطاقة الأشعة السينية في GDA. (ج) لقطة من علامة التبويب فرز كريستال جمع البيانات في GDA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
الشكل 3. وصف البيوكيميائية SP009239-491. (أ) 3D-سطح الرسم البياني التآمر درجة حرارة ذوبان SP009239-491 كدالة لدرجة الحموضة وتركيز كلوريد الصوديوم الحل المخزن المؤقت. (ب) ثانية ومالس نتائج SP009239-491. الاستيعاب في 280 nm يظهر باللون الأزرق. الجماهير المولى للدول أوليجوميريزاتيون مختلفة تظهر باللون الأحمر. وقد تم تعديل لوحة (ب) من32. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
الشكل 4. وصف الهيكلية SP009239-491. (أ) والطاقة امتصاص الأشعة السينية (ب) مسح على حافة الزنك وسراج الدين لبلورات39-491 SP0092. يبين fluorescence المقاسة من الزنك وسراج الدين الذي يحتوي على بلورات أزرق وسماوي، و المحسوبة 'و"نثر الشاذة وأجزاء من الأخضر والأحمر، على التوالي. (ج) أمثلة على أنماط حيود الأشعة السينية التي تم جمعها من بلورات39-491 SP0092. (د) كارتون تمثيل هيكل ديمر39-491 SP0092. بروتومير واحد هو اللون الأبيض وغيرها من البنفسجي (بقايا 39-366) والبنفسجي (بقايا 367-491)، وتظهر ذرات نثر الشاذة ككرات زرقاء وسماوي للزنك وسراج الدين، على التوالي. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.1 M حمض الستريك pH 4.0</td>
			<td>0.1 M حمض الستريك الأس الهيدروجيني 4.5</td>
			<td>0.1 M الفوسفات pH 5.0</td>
			<td>0.1 M سترات pH 5.5</td>
			<td>0.1 M مكررا-تريس pH 6</td>
			<td>0.1 م أدا pH 6.5</td>
			<td>0.1 M والمماسح الأس الهيدروجيني 7</td>
			<td>0.1 M هيبيس درجة الحموضة 7.5</td>
			<td>0.1 M ايميدازول pH 8.0</td>
			<td>0.1 M تريس pH 8.5</td>
			<td>0.1 م أ الأس الهيدروجيني 9</td>
			<td>0.1 م أ pH 9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كلوريد الصوديوم 0 م</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
		
		<tr>
			<td>كلوريد الصوديوم 0.1 M</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كلوريد الصوديوم 0.2 M</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كلوريد الصوديوم 0.5 M</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
			<td>40 ميكروليتر</td>
		</tr>
	

الجدول 1. تكوين المخزن المؤقت للمقايسة التحول الحراري.

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092 at JoVE.com

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

ويرد بروتوكول مبسط للقيام توصيف البيوكيميائية وهيكلية واسعة بروتين ملزمة الركازة الكربوهيدرات من العقدية الرئوية .

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

يبحث إلى الخارج: عزل البوليمرات الكربوهيدرات السيانوبكتيرية المفرج عنها والبروتينات

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...