Name: biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00
Duration: 8 min 53 s
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हम क्लोनिंग में सहायता के लिए OPPF-ब्रिटेन स्वीकार करते हैं, कली हैरिस सेकंड के लिए-मॉल और beamlines I03 और डायमंड लाइट स्रोत पर I04 के वैज्ञानिकों ।

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस पत्र में, हम एस. निमोनियासे प्रोटीन पर एक विशेष बल के साथ कार्बोहाइड्रेट SBPs के जैव रासायनिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन और सत्यापन करते हैं । फिर भी, यह विभिंन जीवों और यहां तक कि अंय असंबंधित घुलनशील प्रोटीन से अंय SBPs के विश्लेषण के लिए एक मानक प्रक्रिया के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
प्रोटोकॉल का पहला हिस्सा प्रोटीन स्थिरता और चतुर्धातुक संरचना पर जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करने पर केंद्रित है, जो क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटीन के नमूनों की तैयारी में शोषण किया जा सकता है । थर्मल शिफ्ट परख अनुभाग में, हम केवल पीएच और NaCl एकाग्रता विविधताओं का वर्णन करने के लिए इस प्रक्रिया की सामांय प्रकृति को बनाए रखने । इस के बावजूद, कई अंय बफर शर्तों एक समान तरीके से परीक्षण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, किसी भी रासायनिक एक स्थिर additive के रूप में इस्तेमाल किया यौगिक सहित: विशेष रूप से वास्तविक ligand (ओं) है कि एक विशिष्ट एसबीपी के लिए बांध में उल्लेखनीय है टी बढ़ाने में कारगरएम कुछ डिग्री सेल्सियस31तक । कुछ मामलों में, denaturing घटता खराब कम संकेत या एक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि, जो प्रोटीन एकत्रीकरण या आंशिक खुलासा के कारण होता है के कारण परिभाषित किया जा सकता है । इस से बचने के लिए, एक प्रोटीन: डाई अनुमापन अस्पष्ट denaturing घटता का अनुकूलन करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । यदि कोई सुधार प्राप्त किया है, विभिंन additives कि प्रोटीन की स्थिरता उंनति कर सकते है स्क्रीनिंग की सलाह दी है, और उपयुक्त स्क्रीन पहले५४बताया गया है ।
आमतौर पर, सबसे SBPs अपने प्राकृतिक वातावरण में monomeric हैं, लेकिन जैसा कि यहां दिखाया multimerization उच्च क्रिस्टलीकरण प्रयोगों में इस्तेमाल किया सांद्रता पर हो सकता है, इस प्रकार oligomerization व्यवहार लक्षण मलों और एसईसी द्वारा प्रदान की जाती है सघन के लिए सबसे अनुकूल स्थिर monodisperse oligomerization राज्य का आकलन करना आवश्यक है. फिर भी, यह प्रोटीन के oligomerization व्यवहार पर क्रिस्टलीकरण हालत में शामिल विभिन्न रसायनों के प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए कठिन है । यदि SEC और मलों की परीक्षा प्रोटीन नमूने के व्यापक एकत्रीकरण से पता चलता है, हम इस होने की संभावना को कम करने के लिए निम्नलिखित सलाह देंगे: ताजा प्रोटीन नमूने का उपयोग करें (फ्रीज-गल नहीं) और थर्मल के साथ प्रदर्शन स्थिरीकरण विश्लेषण का विस्तार बदलाव परख, एक अंतिम संसाधन के रूप में संभव additives और हल्के डिटर्जेंट परीक्षण, एकत्रीकरण को कम करने के लिए । इस पत्र में, हम उच्च प्रवाह विरल मैट्रिक्स वाणिज्यिक क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल की सामांय प्रकृति को बनाए रखने के लिए क्रिस्टलीकरण के लिए बुनियादी दिशानिर्देश पेश करते हैं । हालांकि, उच्च संकल्प एक्स-रे विवर्तन प्रोटीन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए precipitant एकाग्रता, पीएच, रासायनिक additives, अलग तापमान के अलावा के संबंध में क्रिस्टलीकरण की स्थिति का अनुकूलन ट्यूनिंग ठीक चलने की आवश्यकता हो सकती है, और अन्य कारकों क्रिस्टल ड्रॉप और जलाशय16,17के बीच संतुलन गतिशीलता बदल रहा है ।
प्रोटोकॉल के दूसरे भाग के क्रम में प्रोटीन क्रिस्टल के लक्षण वर्णन के लिए एक्स के लिए इष्टतम रणनीति को परिभाषित करने के लिए उदास चरणबद्ध के लिए विषम डेटा के अधिग्रहण पर एक विशेष ध्यान केंद्रित के साथ रे विवर्तन डेटा संग्रह । यहां तक कि अगर SBPs एक समान सामांय वास्तुकला बनाए रखने (और वहां कई जमा 3 डी संभावित मॉडल शुरू करने के रूप में प्रयोग करने योग्य संरचनाओं रहे हैं), आणविक प्रतिस्थापन विधि द्वारा इन प्रोटीन के चरणबद्ध हमेशा की परिवर्तनशीलता की वजह से सीधा नहीं है माध्यमिक संरचना तत्वों और इन प्रोटीन के आंतरिक लचीलापन । इसलिए, हम दुखद तरीका है और प्रकाश डाला है कि इन प्रोटीन पहले से ही आंतरिक रूप से धातु या वास्तव में गैर क्रिस्टलीकरण बफर शर्तों, जो एक के रूप में विषम diffracting तत्वों की एक सीमा प्रदान कर सकते है से धातुओं के विशिष्ट बाध्यकारी हो सकता है प्रस्ताव हमारे सामांय प्रोटोकॉल में मानक कदम ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल SBPs है कि संरचना निर्धारण सफलता दर बढ़ाने के लिए शोषण किया जा सकता है की जैव रासायनिक और संरचनात्मक सुविधाओं का विस्तृत विवरण को सक्षम करने प्रक्रियाओं के एक मानक निर्देशित कार्यप्रवाह परिभाषित करता है, साथ ही तेजी लाने सामांय में SBPs के संरचनात्मक लक्षण वर्णन ।

S. निमोनिया (न्यूमोकोकल) एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु है जो सामान्य रूप से बाँझ niches पैदा करने की क्षमता के साथ मानव श्वसन तंत्र के ऊपरी वायुमार्ग में स्पर्शोन्मुख रहने वाले, मध्यकर्णशोथ, निमोनिया, पूति, गलाघोंटू, और दिमागी बुखार1,2। इसके अलावा, pneumococcal संक्रमण समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया का प्रमुख कारण है, जो दुनिया भर में एक नैदानिक और आर्थिक बोझ के लिए योगदान दे रहा है3,4. एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों के एस निमोनिया दुनिया भर में फैल गया है और हालांकि एक सात valent और एक तेरह valent pneumococcal प्रोटीन संयुग्म वैक्सीन रोगाणुरोधी प्रतिरोध की दर को कम करने में मदद मिली है, प्रतिस्थापन उपभेदों से वैक्सीन का उपयोग करें और उभरा है pneumococcal रोग के लिए नए उपचार के विकास में अनुसंधान के लिए वृद्धि की मांग के लिए नेतृत्व किया है5,6,7,8।
न्यूमोकोकल एक कार्बन स्रोत9,10के रूप में मेजबान से आयातित शर्करा पर निर्भर करता है; वास्तव में यह ३२ अलग कार्बोहाइड्रेट11,12,13के परिवहन के लिए अपनी आयात मशीनरी के 30% भक्त । इन आयातकों में सबसे कम आठ एबीसी-ट्रांसपोर्टर्स13शामिल हैं । एबीसी ट्रांसपोर्टरों में, extracellular SBPs ligand के लिए विशिष्टता का निर्धारण करने में एक मौलिक भूमिका निभाते है और यह कोशिका में ऊपर उठाने के लिए अभिंन झिल्ली ट्रांसपोर्टर को पेश । SBPs नए टीकों और रोगाणुरोधी के डिजाइन के लिए वैध लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करते है क्योंकि वे सतह प्रोटीन और सेलुलर प्रक्रियाओं में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका कर रहे हैं ।
लक्ष्य प्रोटीन लक्षण वर्णन और संरचनात्मक सुविधाओं का विस्तृत विवरण, जैसे ligand जेब और डोमेन लचीलापन, संरचना के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं आधारित दवा डिजाइन14,15. एक्स-रे क्रि के पास परमाणु संकल्प के पास पर प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए पसंद की विधि है, लेकिन क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया अप्रत्याशित, समय लेने वाली है, और हमेशा सफल नहीं है । व्यवस्थित तरीके सफलता दर में सुधार हुआ है और महत्वपूर्ण कारकों नमूना गुणवत्ता और स्थिरता रहे हैं । क्रिस्टलीकरण की सफलता दर प्रोटीन रासायनिक गुण और नमूना तैयारी पद्धति से प्रभावित है । इन के प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन16,17द्वारा सूचित ।
संरचना आधारित डिजाइन के लिए एक और जटिलता crystallographic चरण समस्या है, जो संबोधित किया जाना चाहिए है । के रूप में अधिक प्रोटीन संरचनाओं उपलब्ध हो गए हैं, कई संरचनाओं आणविक प्रतिस्थापन विधि द्वारा हल किया जा सकता है, जो एक मुताबिक़ संरचना18की आवश्यकता है । के रूप में SBPs एक लचीला डोमेन संरचना वर्तमान, आणविक प्रतिस्थापन भी19चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है । यदि एक संरचनात्मक मॉडल है कि पर्याप्त लक्ष्य प्रोटीन के समान है उपलब्ध नहीं है, तकनीक के एक नंबर के लिए प्रायोगिक20चरणबद्ध प्राप्त किया जा सकता है । इन के अलावा, एकल तरंग दैर्ध्य विषम फैलाव (उदास) विधि प्राथमिक तकनीक के रूप में उभरा है और बड़े पैमाने पर किया गया है चरण समस्या21को हल करने के लिए उपयोग । दुखद विधि का उपयोग आगे हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में सुधार के साथ उंनत किया गया है, साथ ही साथ डेटा संग्रह रणनीतियों का पता लगाने और22,23चरणबद्ध के लिए कमजोर विषम संकेतों के उपयोग की अनुमति, 24. इसके अलावा, अणुओं की संरचनाओं को सुलझाने के लिए प्रत्यक्ष तरीकों में अग्रिम, जो परमाणु संकल्प के लिए पिछले आवश्यक विवर्तन डेटा में, अब उदाहरण के लिए, stereochemical ज्ञान के रूप में कार्यक्रम में कार्यांवित के संयोजन द्वारा उपयोग किया जा सकता ARCIMOLDO25. क्रि में चरण समस्या को हल करने के लिए तरीकों की एक उपयोगी समीक्षा टेलर द्वारा दिया जाता है26.
यहाँ हम कार्बोहाइड्रेट परिवहन एसबीपी के लक्षण वर्णन के लिए एक तर्कसंगत प्रोटोकॉल पेश करते हैं, एस. निमोनियाके SP0092, जैव रासायनिक और संरचनात्मक तकनीक को एकीकृत (चित्रा 1). यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल रणनीति के एक उपयोगी उदाहरण परीक्षण के मामले को सामांय में SBPs पर संरचनात्मक अध्ययन की सफलता की दर में सुधार प्रदान करता है, जो जीवन के सभी राज्यों में पाए जाते हैं । विशेष रूप से, प्रोटोकॉल समाधान में एक तेज और प्रभावी विधि में प्रोटीन के सबसे स्थिर oligomeric राज्य निस्र्पक के महत्व पर प्रकाश डाला गया, और सबसे अच्छा प्रजातियों की पहचान करने के लिए क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए अनुवर्ती की अनुमति देता है । हालांकि वहां ५०० एसबीपी संरचनाएं प्रोटीन डेटा बैंक27में रिपोर्ट पर हैं, आणविक प्रतिस्थापन दो α के अंतर्निहित लचीला प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है/β डोमेन, जो एक काज क्षेत्र19से जुड़े हुए हैं । इस प्रकार, प्रोटोकॉल के दूसरे भाग के लिए बाध्य धातु आयनों, जो SBPs में आम है से चरणबद्ध के लिए दुखद तरीका का उपयोग कर वर्णन करता है, साथ ही साथ selenomethionine के शामिल करने और सेलेनियम का उपयोग (एसई) उदास चरणबद्ध में ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SelenoMethionine Medium Complete</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-500</td>
			<td>Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306737</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems&#174; 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S6651</td>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4362143</td>
			<td>The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN HELEOS II</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td></td>
			<td>DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 5/150 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906561</td>
			<td>Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the &#34;increase&#34; version but this model is ideal for the standard day by day use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well &#34;Big&#34; Sitting Drop Crystallization Plate</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td>The 24 well &#34;big&#34; crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Pre-Crystallization Test</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR2-140</td>
			<td>The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6098xx</td>
			<td>Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td>The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Foam Dewar</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-35</td>
			<td>5.7&#34; diameter by 2.8&#34; deep. 800mL capacity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-955</td>
			<td>Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes&#8482; that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puck dewar loading tool</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td>This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092

नई रोगाणुरोधी और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (न्यूमोकोकल) के लिए टीके के विकास के लिए कई प्रतिरोधी उपभेदों में तेजी से वृद्धि को रोकने के लिए आवश्यक हैं । कार्बोहाइड्रेट सब्सट्रेट बाइंडिंग प्रोटीन्स (SBPs) उनके extracellular स्थानीयकरण और pneumococcal चयापचय के लिए कार्बोहाइड्रेट आयात की केंद्रीयता के कारण प्रोटीन आधारित टीकों और नए रोगाणुरोधी के विकास के लिए व्यवहार्य लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमश. यहां वर्णित एक तर्कसंगत एकीकृत करने के लिए बाहर SP0092, जो न्यूमोकोकल और अंय बैक्टीरिया से अंय कार्बोहाइड्रेट SBPs के लिए बढ़ाया जा सकता है की एक व्यापक लक्षण वर्णन ले प्रोटोकॉल है । इस प्रक्रिया के प्रोटीन के इस वर्ग के लिए अवरोधकों के ढांचे आधारित डिजाइन सहायता कर सकते हैं । इस पांडुलिपि के पहले भाग में प्रस्तुत थर्मल शिफ्ट परख, बहु कोण प्रकाश कैटरिंग (मलों), और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), जो की स्थिरता और नमूना निर्देशित की एकरूपता का अनुकूलन द्वारा जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल है क्रिस्टलीकरण परीक्षण और इसलिए सफलता की संभावना को बढ़ाने के । इस प्रक्रिया का दूसरा भाग एक स्वरित्र तरंग दैर्ध्य विषम विवर्तन सिंक्रोट्रॉन beamline का उपयोग कर एसबीपी क्रिस्टल के लक्षण वर्णन है, और डेटा है कि सघन प्रोटीन को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मापने के लिए डेटा संग्रह प्रोटोकॉल संरचना.

इस एकीकृत प्रोटोकॉल चार के साथ सफल साबित किया गया है (दो प्रकाशित और दो अप्रकाशित संरचनाओं) न्यूमोकोकल से छह कार्बोहाइड्रेट बाध्यकारी प्रोटीन लक्ष्य के लिए दिनांक३२,५३विश्लेषण किया । इस खंड में, हम जैव रासायनिक और एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए सामांय में SBPs के संरचनात्मक अध्ययन गाइड प्रस्तुत करते हैं ।
के बाद एसबीपी SP0092 व्यक्त किया गया है और पहले के रूप में परिभाषित शुद्ध३२, शुद्ध प्रोटीन बफर स्थिरता के लिए विश्लेषण किया गया था एक थर्मल शिफ्ट परख का उपयोग: SP0092 प्रदर्शित एक पीएच ६.५ में वृद्धि हुई टीएम और NaCl की उपस्थिति में 0 में-०.२ m एकाग्रता रेंज (चित्र 3ए) । इस के प्रकाश में, निम्न चरणों के लिए बफ़र समाधान के रूप में परिभाषित किया गया था: ०.०२ एम एमईएस पीएच ६.५, ०.२ मीटर NaCl, २.५% (वी/वी) ग्लिसरॉल, ०.५ मिमी TCEP. SP0092 के विभिंन oligomerization राज्यों के निरपेक्ष दाढ़ जन को १८७.२, १४०.८, ९७.०, और ४९.४ केडीए, tetrameric, trimeric, dimeric, और monomeric प्रजातियों के लिए इसी के एक आणविक भार को मापने एसईसी को युग्मित द्वारा मापा गया था, क्रमशः ( चित्र बी) । विभिंन प्रोटीन कमजोर पड़ने पर एसईसी प्रोफ़ाइल के विश्लेषण से पता चला कि oligomerization वृद्धि हुई प्रोटीन एकाग्रता से शुरू होता है, सुझाव है कि बड़े oligomers में आम तौर पर इस्तेमाल की तुलना में उच्च सांद्रता पर अधिक स्थिर है क्रिस्टलीकरण. वास्तव में, व्यापक oligomeric प्रजातियों क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के लिए निर्देशित, सफलतापूर्वक प्रोटीन क्रिस्टल का उत्पादन किया, जबकि मोनोमर प्रजातियों नहीं था ।
SP0092 के मूल और एसई-मिथीयोनाईन लेबल रूपों से प्राप्त अनुकूलित क्रिस्टल एक्स-रे विवर्तन द्वारा विशेषता थे । इन क्रिस्टल से एक्स-रे प्रतिदीप्ति का मापन दोनों मामलों में पता चला Zn के लिए उत्सर्जन चोटियों प्रोटीन के लिए बाध्य किया जा रहा है, जबकि एसई केवल एसई-मिथीयोनाईन क्रिस्टल के लिए उंमीद के रूप में पाया गया था । बाद में, एक्स-रे अवशोषण एसई और Zn किनारों पर स्कैन किया गया है, जो प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करने के लिए घटना एक्स-रे तरंग दैर्ध्य संबंधित एक्स-रे अवशोषण के किनारों के लिए या तो क्रिस्टल में Zn या एसई वर्तमान को अधिकतम करने के लिए विषम संकेत परिणामी डेटा (चित्र 4a-B) से प्राप्य ।
कम संचरण पर तीन विवर्तन पैटर्न को मापने के बाद, एक पूर्ण विषम डेटा सेट एडना (चित्र 4c) द्वारा सुझाए गए डेटा संग्रह कार्यनीति का उपयोग करके प्राप्त किया गया था. विषम संकेत वर्तमान beamline में स्वचालित चरणबद्ध पाइप लाइन से चलाता है उप संरचना का निर्धारण, और प्रारंभिक प्रयोगात्मक चरणों के आधार पर व्युत्पंन, प्रारंभिक नक्शे और मॉडल है, जो फिर परिष्कृत और मांय किया जा सकता है का उत्पादन (चित्रा 4d ).
संक्षेप में, तकनीक के संभावित नुकसान मुख्य रूप से क्रिस्टल की उपलब्धता और गुणवत्ता पर केंद्रित कर रहे हैं । बफर की स्थिति का अनुकूलन प्रोटीन स्थिरता में सुधार के साथ ही प्रोटीन का सबसे उपयुक्त oligomeric राज्य की पहचान के लिए उपयोग करते हैं, जब एक से अधिक oligomer समाधान में पहचान की है, क्रिस्टलीकरण में असफलता के जोखिम को कम कर सकते है मंच. एक प्रारंभिक चरण में की पहचान की बाध्य धातु आयनों के उपयोग का शोषण संरचना समाधान की गति और selenomethionine के अनावश्यक उत्पादन से बचने कर सकते हैं जब आणविक प्रतिस्थापन तरीकों असफल प्रोटीन लेबल.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
चित्र 1. जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट SBPs के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए कार्यप्रवाह का आरेख । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
चित्र 2. जीडीए में क्रिस्टल लक्षण वर्णन। (क) जीडीए beamline कंट्रोल सॉफ्टवेयर के एक्स-रे प्रतिदीप्ति कंट्रोल टैब का स्क्रीनशॉट । (ख) जीडीए में एक्स-रे एनर्जी एज-स्कैन कंट्रोल टैब का स्क्रीनशॉट । (C) जीडीए में डाटा कलेक्शन क्रिस्टल स्क्रीनिंग टैब का स्क्रीनशॉट । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
चित्र 3. SP009239-491के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन । (A) 3 डी-सतह ग्राफ SP009239-491 के पिघलने के तापमान की साजिश रच पीएच के एक समारोह और NaCl बफर समाधान के एकाग्रता के रूप में । (ख) सेक और SP009239-491के लए मलों के नतीजे. २८० एनएम में अवशोषण नीले रंग में दिखाया गया है । विभिन्न oligomerization राज्यों की दाढ़ जनता लाल रंग में दिखाई जाती हैं । पैनल (बी) को३२से संशोधित किया गया है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
चित्र 4. SP009239-491के संरचनात्मक लक्षण वर्णन । (क) और (ख) एक्स-रे अवशोषण ऊर्जा SP009239-491 क्रिस्टल के लिए Zn और एसई एज में स्कैन । Zn और क्रिस्टल युक्त से मापा प्रतिदीप्ति नीले और सियान में दिखाया गया है, गणना एफ ' और एफ "विषम तितर बितर अंश क्रमशः हरे और लाल रंग में हैं । (ग) एक्स-रे विवर्तन SP009239-491 क्रिस्टल से एकत्र पैटर्न के उदाहरण । (घ) SP009239-491 डिमर संरचना का कार्टून निरूपण. एक तोमर सफेद रंग का है और अंय रानी (अवशेषों ३९-३६६) और बैंगनी (अवशेषों ३६७-४९१), और विषम तितर बितर परमाणुओं Zn और एसई, क्रमशः के लिए नीले और सियान गेंदों के रूप में दिखाए जाते हैं । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>०.१ एम साइट्रिक एसिड पीएच ४.०</td>
			<td>०.१ एम साइट्रिक एसिड पीएच ४.५</td>
			<td>०.१ एम फॉस्फेट पीएच ५.०</td>
			<td>०.१ M साइट्रेट पीएच ५.५</td>
			<td>०.१ M भा-tris पीएच 6</td>
			<td>०.१ मीटर एडीए पीएच ६.५</td>
			<td>०.१ एम MOPS नं० 7</td>
			<td>०.१ मीटर HEPES पीएच ७.५</td>
			<td>०.१ मीटर Imidazole पीएच ८.०</td>
			<td>०.१ मीटर Tris पीएच ८.५</td>
			<td>०.१ एम केएस पीएच 9</td>
			<td>०.१ एम केएस पीएच ९.५</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
</tr></tbody></table>			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl ०.१ मीटर</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl ०.२ मीटर</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl ०.५ मीटर</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
			<td>४० μL</td>
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तालिका 1. थर्मल शिफ्ट परख के लिए बफर संरचना ।

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Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया से एक कार्बोहाइड्रेट सब्सट्रेट बाइंडिंग प्रोटीन के एक व्यापक जैव रासायनिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के प्रदर्शन के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है ।

जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

तैयारी और सीरियल गुजरने क्रि लिए lipídic घन चरण में प्रोटीन microcrystals की डिलिवरी

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-एमएस / एमएस में गहन विशेषता के लिए और Glutamine की मात्रा और asparagine Deamidation शॉटगन प्रोटिओमिक्स में

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

पौधों में Mannan कोशिका दीवार Polysaccharides के संरचनात्मक लक्षण का उपयोग कर गति

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

पूरी तरह से स्वायत्त लक्षण वर्णन और जैविक Macromolecules के क्रिस्टल से डेटा संग्रह

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

उपंयास की पहचान CK2 kinase एक बहुमुखी जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग substrates

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

आयन एक्सचेंज क्रोटोग्राफी (आईईईईएक्स) में प्रोटीन पृथक्करण और विशेषीकरण के लिए मल्टी-एंगल लाइट कैटरिंग (मलों) को युग्मित

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

बाहर की ओर देख रहे हैं: Cyanobactrial जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और प्रोटीन के अलगाव

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन की विशेषता मल्टी-एंगल लाइट स्कैटरिंग (एसईसी-मेल्स) के लिए जोड़ा गया

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

एक नई Kinase प्रोटीन के मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर आणविक स्तर पर विशेषता

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...