Name: biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092
Uploaded: 2017-10-02T15:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092 at JoVE.com

Мы признаем ОНПФ-UK для помощи в клонирования, Джемма Харрис SEC-центры и ученые излучение I03 и I04 на источник света алмазов.

Авторы не имеют ничего сообщать.

В этой статье мы описать и проверить Интегрированный протокол для биохимических и структурных характеристик углеводов СБП с уделением особого внимания белки от S. pneumoniae. Тем не менее это может использоваться как стандартная процедура для анализа других СБП из разных организмов и даже другие несвязанных растворимые белки.
Первая часть протокола ориентирована на предоставление биохимических информации о стабильности белка и четвертичной структуры, которая может быть использована в подготовке образцы протеина для кристаллизации. В разделе анализов тепловой сдвиг мы опишем только pH и вариации концентрации NaCl сохранить общий характер этой процедуры. Несмотря на это, многие другие условия буфер может быть проверена в Аналогичным образом, например, включая любое химическое соединение используется в качестве стабилизирующей добавки: в частности фактической ligand(s), привязанные к конкретным SBP чрезвычайно эффективной в повышении Тм на несколько градусов Цельсия31. В некоторых случаях денатурируя кривые могут быть плохо определены связи сигнал низкого или высокого флуоресценции фон, который вызвано агрегации белков или частичной разворачивается. Чтобы избежать этого, белок: краска титрование может выполняться для оптимизации неясным денатурируя кривых. Если улучшения не получается, рекомендуется Скрининг различных добавок, которые могут улучшить стабильность белка, и подходящие экраны были ранее описанных54.
Как правило большинство СБП мономерных в их естественной среде, но как здесь показано, что multimerization может произойти в более высоких концентрациях, используемых в экспериментах кристаллизации, таким образом характеристика поведения олигомеризации, предоставляемый МЭЛС и SEC важное значение для оценки наиболее благоприятный стабильной монодисперсных олигомеризации состояния для кристаллизации. Тем не менее трудно предсказать влияние различных химических веществ, включенных в состоянии кристаллизации на поведение олигомеризации протеинов. Если экспертиза SEC и MALS показывает обширные агрегации белков образца, мы рекомендуем следующие действия, чтобы уменьшить вероятность возникновения такой ситуации: использовать образец свежие протеина (не замораживания размораживания) и раскройте стабилизации анализа с тепловой сдвиг анализов, тестирование можно добавки и мягкими моющими средствами как последний ресурс, чтобы свести к минимуму агрегации. В этой статье мы представляем основные руководящие принципы для кристаллизации, с помощью скрининга коммерческих кристаллизации высок объём разреженных матриц для поддержания общего характера настоящего Протокола. Однако, получение кристаллов протеина высокого разрешения рентгеновской дифракции может потребоваться итеративный тонкой настройки для оптимизации условий кристаллизации в отношении осадителя концентрации, pH, добавления химических добавок, различных температурах, и другие факторы меняющейся динамики равновесия между кристалл падение и водохранилище16,17.
Второй частью протокола описывает характеризации кристаллов белков для определения оптимальной стратегии сбора данных рентгеновской дифракции с особым упором на приобретение аномальных данных для постепенного ГРУСТНО. Даже если СБП поддерживать аналогичные общая архитектура (и есть много хранение 3D структуры, потенциально может использоваться как начиная модели), поэтапного осуществления этих белков методом молекулярной замена не всегда просто из-за изменчивости элементы вторичной структуры и внутренняя гибкость этих белков. Следовательно, мы предлагаем метод ГРУСТНО и подчеркнуть, что эти белки могут уже неразрывно связаны металлов или действительно неспецифической привязки металлов от кристаллизации буфера условий, которые могут обеспечить целый ряд аномальных Дифрагирующая элементов как Стандартный шаг в наш общий протокол.
В заключение этот протокол определяет стандартный рабочий процесс гидом процедур, позволяя подробное описание биохимических и структурных особенностей СБП, которые могут быть использованы для увеличения успеха определение структуры, а также ускорить структурные характеристики СБП в целом.

S. pneumoniae (пневмококк) является грамположительных бактерий, бессимптомно проживающих в верхних дыхательных путей человека дыхательных путей с возможностью переноса обычно стерильные ниши, вызывая отит, пневмония, сепсис, сепсис, и менингит1,2. Кроме того пневмококковой инфекции является основной причиной внебольничная пневмония, которая вносит вклад в клинической и экономическое бремя во всем мире3,4. Устойчивых к антибиотикам штаммов S. pneumoniae распространились по всему миру и хотя семь валентных и тринадцать Валент пневмококковой белка конъюгатной вакцины помогли снизить уровень устойчивости к противомикробным препаратам, замена штаммов от использование вакцины появились и привели к повышенные требования для проведения исследований в целях разработки новых методов лечения для пневмококковой5,6,,78.
Пневмококк зависит от сахара, импортируемых из принимающих как углерода источник9,10; действительно она посвящает 30% ее импорта техники для перевозки 32 различные углеводы11,,12-13. Эти импортеры включают по меньшей мере восемь ABC-транспортеры13. В ABC транспортеров внеклеточная СБП играют основополагающую роль в определении специфики для лигандов и представления его на интегральный мембранный транспортер для поглощения в ячейке. СБП представляют допустимые цели для разработки новых вакцин и антибиотиков, потому что они поверхностных белков и их жизненно важную роль в клеточных процессах.
Характеристика целевых белков и подробное описание структурных особенностей, как лиганд карманы и укорачивания гибкость, служат полезным средством для наркотиков, на основе структуры дизайн14,15. Рентгеноструктурного анализа является методом выбора для структурной характеристики белков в рядом с атомной резолюции, но процесс кристаллизации является непредсказуемым, много времени и не всегда успешно. Систематические методы улучшили показатель успеха и важными факторами являются образец качества и стабильности. Показатель успеха кристаллизации находится под влиянием химических свойств белков и методологии подготовки образца. Эффект этих могут быть оценены и сообщил биохимических характеристик16,17.
Еще один осложняющий фактор для проектирования на основе структуры является кристаллографических фазы проблемы, которые должны быть рассмотрены. Как больше белковых структур стали доступны, многие структуры может быть решена методом молекулярной замены, который требуется гомологичной структуры18. Как СБП структура гибкой домена, молекулярные замена также может оказаться сложным19. Если не доступен структурная модель, которая достаточно похожа на целевого белка, целый ряд методов может использоваться для получения экспериментальных этапов20. Среди них метод Single волны аномальных дисперсии (ЕАД) стала основной методикой и широко используются для решения проблемы этап21. Использование метода ГРУСТНО было дальнейшее развитие с улучшениями в аппаратного и программного обеспечения, а также стратегий сбора данных для обнаружения и использования слабых аномальных сигналов для постепенного22,23, 24. Кроме того, успехи в прямых методов для решения структур макромолекул, которые в прошлом необходимые данные дифракции атомных резолюции, теперь могут быть использованы, например, объединяя стереохимические знаний как реализовано в программе ARCIMOLDO25. Тейлор26дается полезный обзор методов для решения проблемы фазы в кристаллографии.
Здесь мы представляем рационализированных протокол для характеризации углеводный транспорта СПР, SP0092 S. pneumoniae, интеграции биохимических и структурных методов (рис. 1). Этот шаг за шагом протокол предоставляет полезный пример тестового случая стратегий для улучшения успеха структурных исследований на СБП в целом, которые находятся во всех царств жизни. В частности Протокол подчеркивается важность характеризующих наиболее стабильных олигомерных состояние белка в растворе в быстрый и эффективный метод и позволяет выявить лучших видов следить для кристаллизации экспериментов. Хотя есть более 500 SBP структур, сообщили в банк данных белков27, молекулярные замена может быть сложным из-за присущего гибкий характер двух доменов α/β, которые соединены петли регионе19. Таким образом второй частью протокола описывает использование метода ПЕЧАЛЬНО для постепенного от связанных ионов металлов, который является общим в СБП, а также включение селенометионин и использование селена (Se) ГРУСТНО постепенно.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SelenoMethionine Medium Complete</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-500</td>
			<td>Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306737</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems&#174; 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S6651</td>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4362143</td>
			<td>The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN HELEOS II</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td></td>
			<td>DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 5/150 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906561</td>
			<td>Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the &#34;increase&#34; version but this model is ideal for the standard day by day use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well &#34;Big&#34; Sitting Drop Crystallization Plate</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td>The 24 well &#34;big&#34; crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Pre-Crystallization Test</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR2-140</td>
			<td>The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6098xx</td>
			<td>Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td>The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Foam Dewar</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-35</td>
			<td>5.7&#34; diameter by 2.8&#34; deep. 800mL capacity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-955</td>
			<td>Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes&#8482; that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puck dewar loading tool</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td>This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092

Разработка новых противомикробных препаратов и вакцин для пневмококк (пневмококк), необходимо остановить быстрый рост в нескольких устойчивых штаммов. Углеводов субстрата связывания белков (СБП) представляют собой жизнеспособные цели в области развития на основе белков вакцин и новых противомикробных препаратов из-за их внеклеточного локализации и центральной роли импорта углеводов для пневмококковой метаболизма, соответственно. Описанные здесь — это рационализированный Интегрированный протокол провести всеобъемлющую характеристика SP0092, которое может быть распространено на другие углеводы СБП от пневмококка и других бактерий. Эта процедура может помочь проектирования на основе структуры ингибиторов для этого класса белков. Представлены в первой части этой рукописи являются протоколы для биохимического анализа тепловых сдвиг пробирного, мульти угол рассеяния света (MALS) и размер гель-проникающей хроматографии (SEC), которые оптимизировать стабильности и однородности образца направлены на кристаллизации испытания и таким образом повысить вероятность успеха. Второй частью этой процедуры описывает характеристик кристаллов СПР, используя перестраиваемый волны аномальных дифракции Синхротронное излучение и сбор данных протоколы для измерения данных, которые могут использоваться для разрешения кристаллизуется белка структура.

Этот интегрированный протокол доказано, чтобы быть успешным с четырьмя (два опубликованных и два неопубликованных структур) шести углеводов привязки белковых мишеней от пневмококка проанализированы на сегодняшний день32,53. В этом разделе мы представляем биохимических и структурных характеристик SP0092 в результате представителя направлять структурных исследований СБП в целом.
После SBP SP0092 выражена и очищенный как определено ранее32, очищенный протеин был проанализирован для буфера стабильности с помощью тепловой сдвиг пробирного: SP0092 экспонатов и увеличение Tm при pH 6,5 и присутствии NaCl в 0 - 0,2 М диапазон концентраций (рис. 3A). В свете этого, буферный раствор для следующих шагов был определен как: 0,02 М MES рН 6,5, 0,2 М NaCl, 2,5% (v/v) глицерина, 0,5 мм TCEP. Абсолютная Молярная масса государств различные олигомеризации SP0092 был измерен MALS, в сочетании с SEC измерения молекулярной массой 187.2, 140,8, 97,0 и 49,4 кДа, соответствует tetrameric, trimeric, димерной и мономерных видов, соответственно () Рисунок 3B). Анализ профиля SEC в разведениях различных белков показал, что олигомеризации вызвано увеличение белка концентрацию, что свидетельствует о более стабильной в более высоких концентрациях, чем обычно используется в крупных олигомеров кристаллизация. Действительно очищенный крупных видов олигомерных направленных процессов кристаллизации, успешно производства белковых кристаллов в то время как мономер видов не.
Оптимизированный кристаллы, полученные из родной и Se метионина, помечены форм SP0092 характеризовались дифракции рентгеновских лучей. Измерение рентгенофлуоресцентный от этих кристаллов показали в обоих случаях пики выбросов для Zn, привязанной к белка, в то время как Se был обнаружен только для Se метионина кристаллы, как ожидалось. Позже были проведены рентгеновского поглощения сканирует по краям Se и Zn, который при условии, что прямых экспериментальных данных для настройки инцидента волны рентгеновского до соответствующих краев поглощения рентгеновского Zn или Se присутствует в кристаллы, чтобы максимизировать аномальных сигналов доступный из результирующей данных (рис. 4A–B).
После измерения трех дифракционные текстуры на пониженной передачи, аномальных полный набор данных был получен с помощью стратегии сбора данных, предложенный Эдна (рис. 4 c). Аномальных сигналов настоящий триггеры автоматизированных этапов конвейера на излучение определить вложенные структуры, и на основе первоначальных экспериментальных этапов производные, производит первоначальные карты и моделей, которые затем можно уточнить и проверяются (Рисунок 4 d ).
Таким образом потенциальные ловушки техники сосредоточены главным образом на кристалл доступности и качества. Оптимизация условий буфера для улучшения устойчивости белка, а также определение наиболее подходящего олигомерных состояния белка для использования, когда более чем один олигомера определяется в решении, может уменьшить риск неудачи при кристаллизации стадии. Эксплуатации использование связанных ионов металлов, выявленных на ранней стадии может ускорить структуры решения и избежать ненужного производства селенометионина, надписью белка, когда методы молекулярной замена не.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
Рисунок 1. Диаграмма рабочего процесса для биохимических и структурных характеристик углеводов СБП. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
Рисунок 2. Crystal характеристика в GDA. (A) скриншот вкладки управления рентгеновской флуоресценции GDA излучение управляющего программного обеспечения. (B) скриншот рентген энергетического края-управления закладка в GDA. (C) скриншот вкладки скрининг кристалл сбора данных в GDA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
На рисунке 3. Биохимическая характеристика SP009239-491. (A) 3D-поверхности граф заговоре температуру плавления SP009239-491 как функция pH и концентрации NaCl буферного раствора. (B) SEC и MALS результаты для SP009239-491. Поглощение в 280 Нм показаны синим цветом. Молярной массы государств различные олигомеризации показаны красным цветом. Панель (B) был изменен с32. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
Рисунок 4. Структурные характеристики SP009239-491. (A) и (B) рентгеновского поглощения энергии сканирования на краю Zn, Se SP009239-491 кристаллов. Измерений флуоресценции от Zn, Se, содержащие кристаллы показано в синий и бирюзовый, рассчитанные f' и f «аномальных рассеяния фракций находятся в зеленый и красный, соответственно. (C) примеры шаблонов рентгеновской дифракции собранные от SP009239-491 кристаллов. (D) мультфильм представление структуры димера SP009239-491 . Один protomer – цвета белый и другие пурпурный (остатки 39-366) и фиолетовый (остатки 367-491), и аномальных рассеяния атомы представлены как синий и голубой шарики для Zn, Se, соответственно. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0,1 лимонная кислота М рН 4,0</td>
			<td>0,1 лимонная кислота М рН 4.5</td>
			<td>0,1 М фосфат рН 5,0</td>
			<td>0,1 М цитрат рН 5,5</td>
			<td>0,1 бис трис рН М 6</td>
			<td>0,1 М ADA рН 6,5</td>
			<td>0,1 М MOPS рН 7</td>
			<td>0,1 М HEPES pH 7.5</td>
			<td>0,1 М имидазола рН 8,0</td>
			<td>0,1 М трис рН 8,5</td>
			<td>0,1 М CHES рН 9</td>
			<td>0,1 М CHES рН 9,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0,1 М</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,2 М</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.5 M</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
			<td>40 МКЛ</td>
		</tr>
	

Таблица 1. Композиция буфера для assay тепловой сдвига.

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092 at JoVE.com

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Представлен упрощенный протокол для выполнения обширной биохимических и структурных характеристик связывания белка углеводов субстрат из Streptococcus pneumoniae .

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Взгляд наружу: Изоляция цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...