Name: imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using thy1-gcamp6s transgenic mice
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice at JoVE.com

Vi er svært takknemlig til Wenbiao Gan (Skirball Institute, Institutt for fysiologi og nevrovitenskap, New York University School of Medicine, USA) for utmerket teknisk veiledning og Patti Raley, medisinsk Editor (avdeling av nevrologiske kirurgi, Indiana Universitet skolen av medisin), for redigering manuskriptet. Vi takker Dr. Jinhui Chen (Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, USA) for å gi B6. CG-vs (Thy1- YFP) HJrs/J mus. Dette arbeidet var støttes delvis ved grunnleggelsen av direktør i General Hospital i Jinan militære regionen av kinesiske PLA 2016ZD03 (XJL), og NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, fortjener omtale Award I01 BX002356 fra USA Institutt for veteraner Saker, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana ryggmarg og hjerne skader Research Foundation, Mari Hulman George begavelse midler (XMX).

Alle kirurgiske og dyr håndteringsprosedyrer ble utført som godkjent under veiledning for omsorg og bruk av forsøksdyr (National Research Council) og retningslinjene i Indiana universitet skolen av medisin institusjonelle Animal Care og bruk Komité. Skjematisk illustrasjon av 2-fotonet tenkelig oppsettet vises i figur 1.
1. klargjør dyret for Imaging
<ol><li>Plass sterilt gasbind, bomull vattpinner og autoklaveres kirurgiske verktøy innen kirurgi (tabell 1). Slå på en mikro perle sterilisere for intersurgery sterilisering av kirurgiske verktøy.</li>
	<li>Bedøve musen (mann eller kvinne, 1.5-2.5 måneder, 20-25 g) av intraperitoneal injeksjon (IP) av en blanding av ketamin (17.2 mg/mL), xylazine (0.475 mg/mL) og acepromazine (0.238 mg/mL) (6 µL/g kroppsvekt). Vent til den skikkelige dybden av anestesi er nådd når dyret slutter å svare på en tå knipe stimulans og har ingen hornhinnen refleks. Under operasjonen, gi en booster dose av 1/3 originalen dose bedøvelse cocktail som nødvendig for å opprettholde den opprinnelige bedøvende tilstanden.</li>
	<li>Injisere buprenorfin subcutaneously (SC; 0,05-0,10 mg/kg) som et smertestillende middel før kirurgi. Beskyttende salve gjelde øynene til dyret å hindre hornhinnen tørking og cataract formasjon.</li>
	<li>Plass GCaMP6s transgene mus på en varmeputen å hindre nedkjøling og dekke det med et sterilt kirurgisk drapere. Stabilisere dyrets hodet med en leder holder adapter for mus.</li>
	<li>Barbere hodet over det meste av hodebunnen med en dobbel kant razor blad. Rengjør kirurgiske området med en bakteriefri alkohol forberedelse pute etterfulgt av povidon-jod løsning.</li>
</ol>2. kronisk skallen vinduet forberedelse
<ol><li>Gjøre en rektangulær kutt i hodebunnen (2 mm x 3 mm) med en saks på én side (høyre) av skallen. Trykk huden med en bomull swab å opprette en eksponering området > 3 mm i diameter (figur 3A). Fjerne connective vev knyttet til skallen ved forsiktig skraping skallen med en stump Mikrokirurgiske blad (skalpell blad #10; Figur 3 c).</li>
	<li>Merke området S1 ved forsiktig tegne en sirkel (3 mm i diameter, center samordning:-1.5 mm fra bregma og 2,5 mm fra midtlinjen) på skallen med en tannlege bore (figur 2B).</li>
	<li>Utfør samme prosedyre på venstre skallen (figur 2B).</li>
	<li>Påfør et tynt lag av Cyanoacrylate Super lim til benet å gi en base for dental sement program.</li>
	<li>Under dissecting mikroskop, tynne ned en sirkulær groove i skallen rundt S1 området bruker en høyhastighets microdrill (figur 3D). Formålet er å skape en jevn kant for plassering av en optisk vindu på den.</li>
	<li>Gjentatte ganger bruke kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, romtemperatur) til skallen regelmessig under tynning prosessen å lette boring og spre varmen. Utfør boringen midlertidig for å unngå friksjon overoppheting. Suge bort bein avfall med en huset vakuum linje eller en vakuumpumpe.</li>
	<li>Etter ca 2/3 dybdeskarphet benet er boret, sakte og forsiktig tynne resterende 1/3 benet til en rund bit av skallen (bein klaff) er helt fri fra omkringliggende skallen.</li>
	<li>Sakte og forsiktig fjerne sirkulær bein klaff med et par # 5/45 tang og utsette dura (figur 2C; Figur 3E).</li>
	<li>Holde eksponert hjernen regionen fuktig med ACSF (figur 3E). Unngå skade pial fartøy, siden blødning vil endre cerebral blodgjennomstrømning, akselerere hevelse hjernen og sterkt forringe tenkelig kvalitet.</li>
	<li>Den samme fremgangsmåten til venstre (kontralateral) av skallen.</li>
	<li>Montering vinduet optisk, bruk optisk selvklebende lim og kur mellom coverglass lag én om gangen. Eventuelt varme optisk vinduet (50 ° C for 12 h) i en inkubator for å forbedre selvklebende liming. Optisk vinduet består av 2 deler: den øverste delen inneholder et enkelt runde cover glass med en diameter på 5 mm og nederst inneholder 1-3, runde glass cover med en diameter på 3 mm (figur 2D).</li>
	<li>Lagre vinduet optisk i etanol (70%, vol/vol) og skylle den med bakteriefri saline før bruk. Før optisk vindu installasjon, kan du kontrollere vinduet optisk for feil, inkludert feil beløp av optisk klebende eller unøyaktig justering under en stereoscope.</li>
	<li>Installere vinduet optisk over regionen craniotomy (figur 2D). Den øverste delen av vinduet optisk hviler på skallen og den nederste delen av vinduet optisk passer i craniotomized åpning og hviler på dura i nærvær av CSF (figur 2D, E).</li>
	<li>Forsegle den øverste delen av optisk vinduskanten til skallen med Cyanoacrylate Super limet (figur 2F; Figur 3F).</li>
	<li>Når Cyanoacrylate Super limet har tørket, Påfør svart dental sement (Dentsply) å dekke glass kanten. Dental sement gjelder alle synlige skallen og såret margene blokkere lys (figur 2 g-H; Figur 3B).</li>
	<li>Den samme fremgangsmåten til venstre.</li>
	<li>Tillate dyr å gjenopprette på oppvarming pad og dyret buret sitt hjem for gjenoppretting under riktig oppfølging. Gi våt næringen for å lette tygge og hydrering. For å redusere smerte, administrere buprenorfin SC (0,05-2,0 mg/kg) hver 8-12 h postinjury for 2 dager. La musen for å gjenopprette for ytterligere 7 – 10 dager før bildebehandling.</li>
</ol>3. to-fotonet tenkelig
<ol><li>På dagen for eksperimentet, bedøve dyret med ketamin og xylazine (doser og vedlikehold av anestesi som beskrevet ovenfor). Rengjør vinduet skallen med 75% (vol/vol) etanol.</li>
	<li>Plass musen under en tenkelig oppsett består av 2P mikroskop og hodet holder adapteren, hviler på en heten pute med hodet immobilisert gjennom øret barer knyttet til mus hodet innehaver.</li>
	<li>Bilde en side av vinduet optisk samtidig. For å minimere optisk avvik, kontroller at optisk vindu og høyre skallen er orientert vinkelrett på den optiske aksen til mikroskopet.</li>
	<li>Ta en første bilde i vinduet skallen med lyse feltet belysning på 4 x forstørrelse som kart referanse for registrering med høyere forstørring 2P angiographies (figur 4A1).</li>
	<li>Zoom inn på området av interesse med 10 x forstørrelse (figur 4A2).</li>
	<li>Velg et område av interesse i området S1 i kortikale lag I eller II (opptil 150 µm under pial overflaten). Hvis høyere forstørrelse er ønskelig, kan du bruke en 20 X-målet.</li>
	<li>Søke etter en synsfelt med flere neurons. Hente bilder med 2P mikroskop (figur 4B). Bestemme eksponeringstid og eksitasjon lysnivået (≈910 nm) basert på dybden og uttrykk nivå av GCaMP6s, med svakere signaler som krever lengre lukkertider og concordantly mindre tid oppløsning. Vi bruker vanligvis ~ 4 µs per piksel eksponeringstider. Hente bilder på bildefrekvens på 3-5 Hz med en oppløsning på 512 × 512 piksler.</li>
	<li>Begynne å ta tiden serien. Lagre koordinatene for hver region av interesse (ROI) i forhold til vaskulær mønsteret eller fiducial poeng i lav forstørrelse bilder. Bilde av samme avkastning over tid. Utføre samme fremgangsmåte til å observere kalsium dynamikken i S1 området på venstre halvkule. Beregne endringer i fluorescens fra hver avkastning.</li>
	<li>Hente bilder, enten individuelt eller som en time-lapse film (figur 4C1-C3, D, E).</li>
	<li>Studien kortikale blood flow dynamics i vivo av imaging fluorescerende dekstran fargestoffer injisert i halen åre gnagere med 2 P mikroskopi. Bruk vasculatures som landemerker til å gjenkjenne og image samme Avkastningen i imaging økter over lengre perioder.</li>
</ol>4. databehandling
<ol><li>Bruk ImageJ og opprinnelse for bildeanalyser. Importere bildesekvenser med ImageJ (figur 5A-B). For enkeltbilder (eller t-serien filmer), velger du en avkastning innen en bildebasert Nevron og 2 separate nærliggende områder for bakgrunnen måling (figur 5C). Få totalt intensitet med en avkastning manager (figur 5C). Merk: Figur 6 viser representant kalsium bilder. Kalsium forbigående (grønn) og blodkar (rød) show på ulike tidspunkt i sekunder (figur 6A-D) i en mus på 7 d etter første vinduet installasjon. Z-projeksjon av en 3 min opptak periode for røde og grønne kanaler (figur 6E) eller grønne kanalen (figur 6F) vises også. En z-projeksjon viser et komprimert bilde på alle bilder i filmen som en grov og sirkel grense (omfatter Nevron objektet av interesse i alle rammer) velges manuelt og valg av 2 uavhengige i nærheten bakgrunn regioner ( Figur 6G).</li>
	<li>Fra hver avkastning, beregne gjennomsnitt fluorescens bakgrunnen FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 og fluorescens endringene i soma (F) uttrykt som ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.</li>
	<li>Utføre peak analysen steg for steg gjennom funksjonene til ImageJ inkludert planlagte korreksjon, Peak finne/besluttsomhet, Peak integrasjon, Peak montering eller Time-Saving Peak analysefunksjoner.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branch-specific+dendritic+Ca(2+)+spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity.">Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li><li>Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+of+mouse+higher+visual+cortical+areas.">Functional specialization of mouse higher visual cortical areas.</a> Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).</li><li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo.">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).</li><li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li><li>Katona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes.">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+Dendritic+Spines+in+the+Hindlimb+Representation+of+the+Sensory+Cortex+after+Spinal+Cord+Hemisection+in+Mice.">Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), e0132077 (2015).</li><li>Keck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaling+and+homeostatic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex+in+vivo.">Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo.</a> Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).</li><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals.">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li><li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+functional+imaging+in+behaving+rats+using+voluntary+head+restraint.">Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint.</a> Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).</li><li>Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+Microcircuit-Level+Substrates+for+Attention+Are+Disrupted+in+Mouse+Models+of+Autism.">Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism.</a> Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).</li><li>Wachowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+dissection+of+odor+information+processing+in+vivo+using+GCaMPs+expressed+in+specified+cell+types+of+the+olfactory+bulb.">Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

To-fotonet bildebehandling kan samtidig måling av aktiviteten av mange celler med en rimelig oppløsning på opp til ca 800 µm under hjernen overflaten. Vi integrert 2P og en dobbel optisk vindu teknikk med genetisk kodet GCaMP6s å observere kalsium dynamics bestander av lag V neuronal somata ligger > 500 µm under pia. Med åpne optisk Vinduer på hver side av skallen gjør metoden opptak av nevrale aktivitet over symmetrisk pattedyr hjernen regioner for langvarig og stabil kalsium imaging i vivo. Nøkkelen aspektene ved denne metoden inkluderer ytelsen til minimal invasiv kirurgi å lage to åpne skallen optisk Vinduer og 2P imaging neuronal aktivitet i symmetrisk S1 regioner.
Undersøke nettverksaktivitet i bilaterale S1 regioner er et eksempel på hvordan skallen windows kan brukes til å undersøke lokale og symmetrisk informasjonsbehandling i voksen hjernen i vivo. Denne metoden kan også brukes til å studere neuronal aktivitet (f.eks ved hjelp av Thy1 -GCaMP6s mus) og kortikale plastisitet B6. CG-vs (Thy1- YFP) HJrs/J fra intakt vev av tilsvarende symmetrisk regionene i utvinning etter deafferentation på grunn av en ensidig CNS skade. Metoden kan også brukes til å undersøke kortikale aktivitet i respons til perifert stimulering strategier som optogenetic, elektriske eller kjemiske stimulations. Selv om vi bare demonstrere teknikken i S1-området, kan dette brukes til å undersøke aktiviteter i andre symmetrisk områder i levende hjernen som lag V nervecellene i primære motorisk cortex (M1). Observasjoner på omorganisering av hjernen regioner kan gi en neural substrat for adaptive motor atferd, som spiller en avgjørende rolle i postinjury utvinning av funksjonen. Det gjør det også mulig for kronisk måling av symmetrisk aktiviteten av genetisk identifiserte celler under virkemåte i hodet-fast mus.
Teknisk, etterforskere bør betale forsiktig oppmerksomhet til kvalitet og konsistens av dobbelt skallen windows. Tynnet skallen skallen vinduet teknikk 12 er sterkt anbefalt for nybegynnere å øve. Spines er kalsium rom deres morfologi og lokale tilstrømningen og ekstrudering mekanismer. I denne studien brukte vi B6. CG-vs (Thy1- YFP) HJrs/J mus som et eksempel å demonstrere dendrittiske ryggraden dynamikken i vivo (Figur 4). En åpen-skallen glass vindu installasjon kan forårsake høy fjellrygg omsetning og reaktive glial svar etter kirurgi 12. Derimot med tynnet skallen vinduet teknikken, kan spines og dendrites være godt bevart.
Valg av dimensjoner og tykkelser av optisk windows vil være avhengig av ønsket synsfelt, skallen kurvatur, skallen tykkelse og typen tenkelig 13. Utilstrekkelig presset av den optiske coverglasses på dura kan forårsake fortykkelse av dura, gjenvekst av skallen, og økt hjernen bevegelse. Derimot kan hardt av den optiske coverglasses hindre kortikale blodstrøm.
For optisk vindu samlingen, lim og kurere flere lag med coverglasses en samtidig med optisk lim og lang-bølgelengde UV-lyset. For å styrke den selvklebende bånd, varme fabrikkerte vinduet (50 ° C for 12 h) i en inkubator. Lagre optisk vindu coverglass i 70% (vol/vol) etanol og før operasjonen, skyll den med sterilt saltvann. Vinduet optisk må undersøkes for feil (for eksempel feil beløp av optisk klebende eller unøyaktig justering) under en stereoscope før bruk for å unngå feilen. Hvis den optiske lim er for tynn, kan luft mellomrom være brettet, som kan forårsake optisk avvik eller dekke glass avdeling på implantasjon. Derimot kan mye optisk lim forårsake overflyt forbi kantene av vinduet skallen.
Oppsummert her beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å måle kalsium dynamics eller dendrittiske morfologi gjennom skallen windows fra 2 symmetrisk primære somatosensory kortikale områder i Thy1-GCaMP6s og Thy1- YFP transgene mus, henholdsvis bruker 2P mikroskopi. Denne teknikken kan forenkle dissekere komplekse strukturelle og funksjonelle forholdet mellom neural nettverk.

Kalsium og dens regulering er viktig på formidling flere fysiologiske prosesser. Overvåking kalsium dynamics er nyttig for å forstå vanlig hjernefunksjon samt pathological betingelser hjernen lidelser 1,2,3,4,5,6 ,7,8. Imaging GCaMP6s fluorescens er et kraftig verktøy for å kvantifisere spike tall, timing, frekvens, samt nivåer av synaptic inndata både i vitro og vivo 9,10,11.
Pattedyr hjernen utstillinger merket symmetri over sagittal flyet. Selv om nyere nevrologiske forskning har kaste lys over kortikale remodeling og neuronal aktivitet utløst av traumatiske hjernen eller ryggmargen skaden 6,7rollene som intakt vev av symmetrisk spille tilsvarende regioner i utvinning er fremdeles uklar.
I denne studien beskrive vi eksperimentelle prosedyrene for å opprette bilaterale symmetrisk optisk Vinduer for i vivo bildebehandling. Bruker disse optisk windows, beskrive vi måling av kalsium dynamikken fra primær somatosensory halvdelene (S1) i GCaMP6s transgene mus med 2P mikroskopi. I delen resultater vise vi også i vivo dendrittiske morfologi på ulike tidspunkt i regionen S1 i EGFP transgene mus med 2 P imaging. Metoden observasjon om nettverket dynamikken i bilaterale S1 områder er bare første eksempel hvordan åpne skallen Windows vil hjelpe nevrologer å undersøke lokale og symmetrisk informasjonsbehandling i voksen pattedyr hjernen i normal betingelser eller annen sykdom modeller i vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<tbody>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:208px;">C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J</td>
			<td style="width:103px;">Jackson</td>
			<td align="right" style="width:83px;">24275</td>
			<td style="width:249px;">Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:208px;">B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.</td>
			<td style="width:103px;">Jackson</td>
			<td align="right" style="width:83px;">7919</td>
			<td style="width:249px;">Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:208px;">Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel</td>
			<td style="width:103px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:83px;">11251-30</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:208px;">Dumont no. 5SF forceps</td>
			<td style="width:103px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:83px;">11252-00</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:208px;">Micro Bead Sterilizer</td>
			<td style="width:103px;">Southern Labware</td>
			<td style="width:83px;">B1201</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:208px;">Harishige&#8217;s SG-4N Head Holding Adaptor</td>
			<td style="width:103px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:83px;">SG-4N</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:208px;">Ideal Micro-Drill Complete Kit</td>
			<td style="width:103px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:83px;">72-6065</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:208px;">Burrs for Micro Drill</td>
			<td style="width:103px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:83px;">19007-05</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:208px;">Round cover glass, 3 mm</td>
			<td style="width:103px;">Harvard Biosciences</td>
			<td style="width:83px;">W4 64-0720</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:208px;">Round cover glass, 5 mm</td>
			<td style="width:103px;">Harvard Biosciences</td>
			<td style="width:83px;">W4 64-0700</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:208px;">Norland optical adhesive</td>
			<td style="width:103px;">Norland Products</td>
			<td align="right" style="width:83px;">7106</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:208px;">Loctite liquid super glue</td>
			<td style="width:103px;">WB Mason</td>
			<td style="width:83px;">LOC1647358</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:208px;">Grip cement kit, powder and solvent</td>
			<td style="width:103px;">Dentsply</td>
			<td align="right" style="width:83px;">675570</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:208px;">Gel foam</td>
			<td style="width:103px;">Moore Medical</td>
			<td align="right" style="width:83px;">2928</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:208px;">Micro dissecting scissors</td>
			<td style="width:103px;">Roboz</td>
			<td style="width:83px;">RS-5841</td>
			<td style="width:249px;">Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:208px;">Artificial cerebrospinal fluid (ASF)</td>
			<td style="width:103px;">-</td>
			<td style="width:83px;">-</td>
			<td style="width:249px;">The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using thy1-gcamp6s transgenic mice

Pattedyr hjernen utstillinger merket symmetri over sagittal flyet. Detaljert beskrivelse av nevrale dynamikken i symmetrisk hjernen regioner i voksen pattedyr dyr er imidlertid fortsatt flyktig. I denne studien, beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å måle kalsium dynamics gjennom doble optiske Vinduer over bilaterale primære somatosensory corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgene mus med 2-fotonet (2 P) mikroskopi. Denne metoden gjør opptak og quantifications av nevrale aktivitet i bilaterale musen områder av hjernen en samtidig i samme eksperiment for en lengre periode i vivo. Nøkkelen aspektene ved denne metoden, som kan fullføres innen en time, inkluderer minimal invasiv kirurgi prosedyrer for å lage to optiske windows, og bruk av 2P bildebehandling. Selv om vi bare demonstrere teknikken i området S1, kan metoden brukes til andre regioner av levende hjernen tilrettelegge utviklingen av strukturelle og funksjonelle kompleksiteten i hjernen neural nettverk.

I vinduet bilaterale optisk, fikk vi resultatene fra 2 separate forsøk. Det første eksperimentet ansatt EGFP-uttrykke mus til bildet dendrittiske varicosities. Figur 4C 1-3 viser eksempler på bilder tatt på ulike tidspunkt etter optisk vindu implantasjon. Merk at antall og plassering av dendrittiske grener og spines er bemerkelsesverdig stabilt mellom 2 (Figur 4 d, E, z-projeksjon).
Andre eksperimentet ansatt Thy1 -GCaMP6s transgene mus å måle intracellulær kalsium forbigående, dermed illustrerer hvordan kalsium fysiologi kan måles i en enkelt Nevron i vivo (figur 6). Denne teknikken kan brukes til å registrere og kvantifisere spontan aktivitet i populasjoner av lag V pyramidale nevroner ligger så dypt som > 500 µm under pia. Gjennomsnittlig spontan svar over tid (beregnet som gjennomsnittet svar på hvert tidspunkt) kan beregnes over rekke prøvelser. 2P teknikken har fordelen av å oppdage aktivitet samtidig store eller spredt neuronal bestander over en lengre periode med liten mekaniske forstyrrelser til hjernen i forhold til multielectrode innspillinger.
Vil generere en akseptabel gjennomsnittlig måling, er 5-10 forsøk anbefalt. Antallet forsøk vil være avhengig av spontane svar eller iboende variasjon av svarene på en bestemt stimulering. Hvis alle trinnene som følges strengt, som beskrevet ovenfor, forsker opplært i begge tynnet skallen skallen vinduet teknikk og i vivo 2 P kalsium imaging skal kunne få opptak av 100-200 neurons på begge sider fra 1 – 2 dyr per dag.
Etter toppen analysen, kan en samling av resultatene som den virkelige plasseringen av toppen, ekte amplituden, området og full bredde på halv maksimum (FWHM) for hver topp oppnås.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig1.jpg"> Figur 1 : Mactac komponentene i et skallen optisk vindu for 2-fotonet (2P) bildebehandling. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig2.jpg"> Figur 2 : Skjematisk tegning viser hovedtrinnene for å forberede et skallen vindu. (A) Under dissecting mikroskop, fjerne hud over det kirurgiske området med en kirurgisk saks. (B) bruk en høyhastighets microdrill å produsere en sirkulær groove (3 mm diameter) på skallen over S1 området til benet klaff i sporet blir løsrevet fra det omkringliggende benet. (C) Fjern sakte bein klaffen å utsette underliggende dura. (D) sette optisk vinduet med coverglasses med 2 forskjellige diametere. Den øvre coverglass har en større diameter (5 mm) og av lavere coverglasses (vanligvis 1-3) har mindre diameter (3 mm). Tykkelsen på coverglasses installeres vil være avhengig av tykkelsen på skallen. (E) sted coverglass på sirkulære åpningen av skallen å opprette et optisk vindu. Den nedre delen av coverglasses skal passe i skallen åpningen. Nederst i coverglasses bør forsiktig kontakte dura. (F) Seal vinduet kanter til skallen med cyanoacrylate lim. (G) når cyanoacrylate tørker, svart dental sement lateral gjelder lim veggen. (H) fyller vinduet skallen med ddH2O og bruk vann nedsenking mål for bildebehandling. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig3.jpg"> Figur 3 . Etableringen av bilaterale Vinduer på skallen. (A) A fotografisk bilde viser 2 skallen optisk Vinduer på hver side av skallen overliggende S1 området. (B) forstørring eske regionen i bildet (A) viser bilaterale optisk windows eksponere den underliggende dura og blodkar. Skala bar = 680 µm. (C) utsatt skallen. (D) opprette en sirkulær groove som en sentral bein klaff er sett. Skala bar = 900 µm. (E) etter fjerning av bein klaffen, skallen åpningen var fylt med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF). Skala bar = 720 µm. (F) installasjon av vinduet optisk skallen åpningen og tetting kanten av vinduet med superlim. Dura og blod fartøy er synlig gjennom vinduet optisk. Skala bar = 600 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig4.jpg"> Figur 4 : Kalsium og dendrittiske bildebehandling. (A1) Identifisere områder av interesse ved hjelp av blodkar (BV) som landemerker i Thy1-GCaMP6s mus. (A2) Identifisere de samme merkede cellene (røde piler) over tid med samme landemerker og posten. (B) representant Z-projeksjon av kalsium signaler i nevronene (røde piler) på primære somatosensory cortex (S1). Skala bar = 10 µm. (C1-3) visualisering av dendrites (grønn) og en blodåre (rød) i B6. CG-vs (Thy1- YFP) HJrs/J på ulike dybder i laget II av S1 regionen på 1 dag etter optisk vindu installasjon. (D) Z-projeksjon av flere bilder på samme område på 1 dag. (E) Z-projeksjon av flere bilder på samme område på 7 dager etter optisk vindu installasjon. Merk bemerkelsesverdig stabiliteten av nummeret og plasseringen av voksen spines og dendrittiske grener mellom 1 dag og 7 dager etter optisk vindu installasjon. Skala bar = C-E 5 µm (C-E). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig5.jpg"> Figur 5 : Kalsium signal sporing. (A, B) Eksempler på importerte t-serie filmer med ImageJ for dataanalyse 2 neurons (neuron 1 og Nevron 2, henholdsvis). (C) en regneark viser data på belysning intensitet fra regionen rundt (ROI; Nevron og 2 separate nærliggende områder som bakgrunn tiltak). (D) beregning av toppen: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (gjennomsnittlig fluorescens bakgrunnen [FB] og fluorescens endringene i soma [F] uttrykt som ΔF/F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig6.jpg"> Figur 6 . Representant kalsium bilder. (A-D) Kalsium forbigående (grønn) og blod fartøy (rød) på forskjellige tidspunkt i sekunder i en mus på 7 dager etter optisk vindu installasjon. Gul pil: en relativt mindre aktive Nevron. Hvit pil: en spiking Nevron. (E, F) Z-projeksjon av en 3 min opptak periode for rød (blod fartøy) og grønn (kalsium) kanaler (E) og grønne kanalen bare (F). (G) valgt neurons og deres tilstøtende bakgrunn områder er merket. Skala bar = 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice at JoVE.com

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Vi beskriver en eksperimentell prosedyre for å måle neuronal aktivitet gjennom doble optiske windows over bilaterale primære somatosensory corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgene mus med 2-fotonet (2 P) mikroskopi i vivo.

Imaging nevrale aktivitet i primære Somatosensory Cortex ved hjelp av Thy1-GCaMP6s transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Denne metoden muliggjør opptak og kvantifisering av nevrale aktivitet på tvers av mus bilaterale kortikale regioner for en lengre periode in vivo. De to fotonteknikken har fordelen av å oppdage aktivitet samtidig i stor eller spredt nevronal befolkning over en lengre periode. Implikasjonene av denne teknikken strakte seg mot undersøkelse av aktivitetsmønstre i definerte nevronale populasjoner i forskjellige regioner i den levende hjernen.12 timer før du begynner prosedyren, varm de optiske vinduene ved 50 grader Celsius i 70% etanol. Et optisk vindu består av et rundt fem millimeter diameter toppdeksel glass og en bunndel som inneholder en rund tre millimeter diameter cover glass. På slutten av oppvarmingen inkubasjon, bekrefter mangel på respons på tå klemme på en bedøvet 20 til 25-gram 1 1 / 2 til 2 1 / 2 måned gammel Thy1 GCaMP6s mus, og bruke salve på dyrets øyne.Plasser musen på en varmepute dekket med en steril drapering og bruk en hodeholderadapter for mus for å stabilisere hodet. Barber det meste av hodebunnen med en dobbel kant barberhøvel, og rengjør den eksponerte huden med sekvensielle sterile alkoholforberedelsesputer og povidone-jodoppløsningskrubber. Bruk deretter en saks for å lage en rektangulær to og tre millimeter kuttet i hodebunnen på høyre side av skallen.Bruk en bomullspinne til å skyve huden til side for å skape et eksponeringsområde på mer enn tre millimeter i diameter, og bruk et sløvt mikrokirurgisk blad for å forsiktig fjerne bindevevet festet til skallen. Med en tannbor, forsiktig merke en tre millimeter diameter sirkel rundt S1-området. Etter å ha gjort en lignende sirkel på venstre side av skallen, påfør et tynt lag med cyanoacrylate superlim på begge sider av beinet for å gi en base for en tannsementapplikasjon.Under et dissekerende mikroskop, bruk en høyhastighets mikrobor for å tynne ned et sirkulært spor i høyre side av skallen rundt S1-området for å skape en jevn kant, og aspirere beinrester med vakuum etter behov. Etter at en ca. 2/3 bendybde er oppnådd, tynner du forsiktig de resterende 1/3 av beinet til en sirkulær beinklaff er helt frigjort fra den omkringliggende skallen. Bruk et par 5/45 tang til å sakte og forsiktig fjerne det sirkulære benstykket for å utsette duraen, vær forsiktig for å unngå å skade pialkarene.Etter å ha fjernet en beinklaff fra venstre side av skallen på samme måte, skyll det optiske vinduet for høyre side av skallen med steril saltvann, og se etter feil under et stereomikroskop. Installer det optiske vinduet over kraniotomiområdet med den øverste delen av vinduet som hviler på skallen og den nederste delen i den kraniotomiserte åpningen, hviler på duraen, i nærvær av cerebral spinalvæske. Bruk cyanoacrylate superlimet til å forsegle den øverste delen av den optiske vinduskanten til skallen.Når limet har tørket, påfør svart tannsement på kanten av glasset, resten av høyre side av den eksponerte skallen og sårmargene for å blokkere lyset. Installer deretter det venstre optiske vinduet og la dyret komme seg med overvåking til full recumbency. Syv til 10 dager etter inngrepet, plasser det bedøvede dyret i hodeholderadapteren på en varmepute under et to-fotonmikroskop, og ta vare på at det optiske vinduet og høyre side av skallen er orientert vinkelrett på mikroskopets optiske akse.Skaff deg et innledende referansekartbilde av kranialvinduet ved hjelp av lysfeltbelysning på fire ganger forstørrelse. Etter å ha fått flere bilder av samme interesseregion, bilde kalsiumdynamikken i S1-området på venstre halvkule og beregne endringene i fluorescensen fra hver interesseregion på begge sider av skallen. I disse representative bildene ble dendritter og et blodkar i en EGFP-uttrykkende mus visualisert på forskjellige dybder i lag to av S1-regionen en dag etter installasjon av det optiske vinduet.Z-projeksjonsbildene ble tatt på dag en og syv etter den optiske vindusimplantasjonen, som illustrerer et bemerkelsesverdig stabilt antall og plassering av dendrittiske grener og spines over den eksperimentelle perioden. Måling av intracellulær kalsiumtransient i Thy1 GCaMP6s transgene mus tillater kvantifisering av spontan kalsiumaktivitet og populasjoner av lag fem pyramidale nevroner som ligger så dypt som større enn 500 mikrometer under pia, samt beregning av gjennomsnittlig antall spontane responser over tid. En forsker utdannet i både kranial vindu forberedelse og in vivo to-foton kalsium imaging teknikker bør være i stand til å få opptak av 100 til 200 nevroner på begge sider av skallen i ett til to dyr per dag.Med et åpent optisk vindu på hver side av skallen, gjør metoden det mulig å registrere nevrale aktiviteten på tvers av symmetriske pattedyrhjerneregioner for langvarig og stabil kalsiumavbildning in vivo. Denne metoden kan også brukes til å studere kortikal aktivitet og plastisitet etter ensidig skade på perifert eller sentralnervesystemet. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du installerer bilaterale kraniale vinduer for måling av kalsiumdynamikk ved hjelp av to-fotonmikroskop i Thy1 GCaMP6s transgene mus.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning av Microregional Hypoksi i Mus Cerebral Cortex av to-foton Imaging av endogen NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-enheten opptaket Metoder for å karakterisere nevrale aktiviteten i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactory kretser

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Innspilling elektriske aktiviteten fra Identifiserte Nerveceller i Intakt Norgesmester Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse av nevrale aktiviteten med Laser Illumination i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Levende Imaging av Mitosis i utviklings Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Ekstracellulære opptak av neuronal aktivitet kombinert med Microiontophoretic Bruk av neuroaktive stoffer i Awake Mus

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminesens Imaging av nevroinflammasjon i transgene mus etter Peripheral Inokulering av Alfa synukleinfibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live bildebehandling av primære hjernebarken celler ved hjelp av en 2D kultur-systemet

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live bilder av GLUT4 Protein menneskehandel musen primære hypothalamus nevroner bruker Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...