Name: targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

أيد هذا البحث العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الكندي الهندسية (05239 إلى P.B.S.)، والمؤسسة الكندية لصندوق بحوث الابتكار/أونتاريو (إلى P.B.S.)، ومؤسسة محاربة البروستات سرطان-ركوب تيلوس لأبي (ل P.B.S.) واونتاريو الحصول على منحة الدراسات العليا (ل Y.J.C. ونوفاسكوتيا).

1-تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)-وساطة الطفرات موقع الموجه لإدماج Cys في ناقل تعبير بكتيرية الحيوانات الأليفة-28 ألف-
<ol><li>تحديد تركيز ناقلات الحيوانات الأليفة-28 ألف (أي دنا الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) معامل انقراض سم (ميكروغرام/مل) 0.020 <s...

جليكوسيليشن البروتين تعديل بوستترانسلاشونال حيث تساهمي المرفقة السكريات البروتينية أساسا عن طريق الروابط إلى سلاسل الحمض الأميني الجانبية. ما يصل إلى 50% بروتينات الثدييات هي الغليكوزيلاتي 54، حيث أن البروتينات الغليكوزيلاتي فيما بعد يمكن أن يكون مجموعة متنوعة من التأثيرات ...

تخزين الكالسيوم تعمل (Ca2 +) إدخال (سوسي) هو الطريق الرئيسية التي تأخذ الخلايا المناعية يصل Ca2 + من الفضاء خارج الخلية إلى سيتوسول. في الخلايا اللمفية تي، ربط مستقبلات خلية تي يقع في غشاء البلازما (م) مولدات المضادات التي تنشيط بروتين تيروزين مؤنزم (استعرض في 1،،من23). سلسلة الفسفرة يؤدي إلى تنشيط phospholipase-γ (PLCγ) الذي يتوسط التحلل المائي لغشاء فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2) فيما بعد إلى دياسيلجليسيرول واينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي (IP3 ). الملكية الفكرية3 هو رسول ديفوسيبلي صغيرة التي تلزم للملكية الفكرية3 مستقبلات (IP3R) في هيولى (ER) مما فتح هذه القناة مستقبلات وسمحت Ca2 + تدفق أسفل التدرج تركيز لائحة التجويف إلى سيتوسول (استعرض في 4). مستقبلات الإشارات من البروتين ز إلى جانب وتيروزين كيناز مستقبلات في مجموعة متنوعة من الرصاص أنواع منفعل وغير منفعل خلية أخرى لإنتاج نفس IP3 والتنشيط للملكية الفكرية3روبية.
سبب المحدودة Ca2 + السعة التخزينية للائحة، الملكية الفكرية3-الإفراج عن الوساطة والزيادة الناتجة في كاليفورنيا سيتوسوليك2 + فقط عابر؛ ومع ذلك، آثار هذا استنفاد ER لومينال Ca2 + عميقا نوع التفاعل stromal جزيء-1 (STIM1)،--أنا ترانسميمبراني (TM) العثور على البروتين معظمها على غشاء ER 5،،من67. STIM1 يحتوي على المنحى التجويف Ca2 + الاستشعار عن مجال تتكون من زوج EF-اليد والعقيمة α-عزر (أفسام). يتم فصل ثلاثة مجالات لفائف ملفوف المنحى سيتوسوليك من أفسام بالمجال TM واحد (في 8استعراض). عند ER Ca2 + نضوب لومينال، يخضع أفسام9 7،أوليجوميريزاتيون إلى جانب زعزعة الاستقرار التي تسبب ترتيبات هيكلية جديدة من الخرائط المواضيعية والمجالات لفائف ملفوف 10. تتوج هذه التغييرات الهيكلية في تعويض STIM1 في ER-م تقاطعات 11،12،،من1314 من خلال التفاعلات مع فوسفوينوسيتيديس الساعة 15، 16 و Orai1 مفارز 17،18. Orai1 البروتينات هي مفارز م فيها تجميع للنموذج Ca2 + قنوات 19،20،،من2122. تسهيل التفاعلات STIM1-Orai1 في تقاطعات ER-م فتح Ca2 + الإفراج عن تنشيط Ca2 + (قلعة) قناة المطابقة التي تمكن الحركة من Ca2 + في سيتوسول من تركيزات عالية الفضاء خارج الخلية. في الخلايا المناعية، حمل سيتوسوليك المطرد Ca2 + المرتفعات عبر قنوات قلعة Ca2 +-كالمودولين/calcineurin تعتمد ديفوسفوريليشن للعامل النووي من خلايا تي المنشط الذي يدخل بعد ذلك النواة و يبدأ تنظيم النسخي الجينات تعزيز تي خلية التنشيط 1،3. ما يسمى عملية التنشيط قناة قلعة STIM1 23،24 عن طريق فعل مؤثر ER لومينال Ca2 + نضوب والناتجة عن المطرد سيتوسوليك Ca2 + الارتفاع جماعي سوسي 25. يتضح الدور الحيوي الذي تؤديه سوسي في خلايا تي بدراسات تثبت أن الطفرات الموروثة في كل من STIM1 و Orai1 يمكن أن تسبب نقص المناعة المشتركة الشديد المتلازمات 3،،من1926، 27-يبدأ أفسام سوسي بعد الاستشعار ER لومينال Ca2 + استنفاد عبر فقدان Ca2 + التنسيق على يد EF الكنسي، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى رابطة الذاتي إلى جانب زعزعة الاستقرار 7، 28،29.
جليكوسيلاتيون هو مرفق التساهمية وتجهيز الهياكل oligosaccharide، ويعرف أيضا باسم جليكانس، من خلال مختلف الخطوات السكروز في ER وغولجي (استعرض في 30،،من3233). هناك نوعين الغالب من جليكوسيلاتيون في حقيقيات النوى: N-مرتبط و يا-مرتبطة، اعتماداً على الأحماض الأمينية المحددة وذرة سد الربط. ترفق أميد سلسلة جانبية من Asn في N-جليكوسيليشن، جليكانس، وفي معظم الحالات، يحدث خطوة البدء لائحة ببتيد سلسلة التحركات في التجويف 34. وتتمثل الخطوة الأولى من N-جليكوسيليشن نقل بنية أساسية أربعة عشر-السكر تتكون من الجلوكوز (الأخضر)، ويطلق (رجل) و نون-أسيتيلجلوكوساميني (جلكناك) (أي الأخضر3رجل9جلكناك2) من ER غشاء الدهن 35،أوليجوساكتشاريلترانسفيراسي36. مزيد من الخطوات، مثل الانقسام أو نقل مخلفات السكر، التي تحفزها لائحة محددة جليكوسيداسيس وجليكوسيلترانسفيراسيس. يمكن أن تكون بعض البروتينات التي تترك لائحة وأن تنتقل غولجي كذلك المجهزة 37. س-جليكوسيلاتيون يشير إلى إضافة جليكانس، عادة إلى مجموعة الهيدروكسيل سلسلة الجانب بقايا سر أو منتدى المجالس الرومانسية، ويحدث هذا التعديل تماما في 33،مجمع غولجي34. وهناك العديد من الهياكل-جليكان سالتي يمكن أن تتكون من N-أسيتيلجلوكوساميني، فوكوسي، واللبن، وإضافة حمض اللعابي مع كل أحادي التسلسل 33.
في حين تم التعرف على لا تسلسل معين كشرط أساسي لأنواع عديدة من س-جليكوسيلاتيون، ارتبط تسلسل آراء مشتركة N-يرتبط التعديل: Asn-X-Ser/الثريونين/Cys، حيث X يمكن أن يكون أي من الأحماض الأمينية ما عدا المحترفين 33. أفسام STIM1 يحتوي على اثنين من هذه المواقع-glycosylation توافق N: Asn131-Trp132-Thr133 و Asn171-Thr172-Thr173. وفي الواقع، أظهرت الدراسات السابقة أن أفسام ن-الغليكوزيلاتي في خلايا الثدييات في Asn131 و Asn171 38،39،،من4041. بيد أن الدراسات السابقة المترتبة على N-جليكوسيليشن على سوسي كانت تتعارض، مما يوحي بقمعها، بوتينتياتيد أو أي تأثير من هذا التعديل بوستترانسلاشونال في، سوسي التنشيط 38= "xref" >40،،3941. وهكذا، البحوث المتعلقة بآثار أفسام N-جليكوسيليشن الفيزيائية-الحيوية والكيمياء الحيوية والهيكلية الكامنة وراء أمر حيوي لفهم الآثار التنظيمية لهذا التعديل. بسبب الحاجة إلى مستويات عالية من البروتينات متجانسة في هذه التجارب في المختبر ، تم تطبيق نهج موقع انتقائي لإرفاق الجلوكوز مويتيس أفسام تساهمي. من المثير للاهتمام، جليكوسيليشن Asn131 و Asn171 بسبب التغييرات الهيكلية التي تتقارب داخل نواة أفسام وتحسين الخصائص الفيزيائية-الحيوية التي تنهض بوساطة STIM1 سوسي 42.
ملحق الكيميائية من جماعات glycosyl ثيولس Cys كانت راسخة بعمل المنوي التي أثبتت فائدة هذا النهج خال من إنزيم لفهم آثار خاصة بالموقع جليكوسيلاتيون على وظيفة البروتين 43 أولاً , 44-في الآونة الأخيرة، وفيما يتعلق STIM1، كانت تحور بقايا Asn131 و Asn171 إلى Cys و glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] وكان يستخدم لربط تساهمي الجلوكوز ثيولس الحرة 42. وهنا، يمكننا وصف هذا النهج الذي لا يستخدم الطفرات لإدراج موقع بقايا Cys محددة لتعديل فحسب، بل ينطبق أيضا على حل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) لسرعة تقييم كفاءة التعديل والهيكلية الاضطرابات نتيجة جليكوسيليشن. جدير بالذكر أن هذه المنهجية العامة يمكن تكييفها بسهولة دراسة آثار أما O-أو N-جليكوسيليشن أي ريكومبينانتلي إنتاج البروتين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Use in step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1163</td>
			<td>Use in step 1.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>R0176</td>
			<td>Use in step 1.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presto Mini Plasmid Kit</td>
			<td>GeneAid, Inc.</td>
			<td>PDH300</td>
			<td>Use in step 1.16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>230280</td>
			<td>Use in step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli</td>
			<td>Invitrogen, Inc.</td>
			<td>18265017</td>
			<td>Use in step 1.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm Syringe Filter</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Use in step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88221</td>
			<td>Use in step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,500 Da MWCO Dialysis Tubing</td>
			<td>BioDesign, Inc.</td>
			<td>D306</td>
			<td>Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Thrombin</td>
			<td>BioPharm Laboratories, Inc.</td>
			<td>SKU91-055</td>
			<td>Use in step 3.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5156-01</td>
			<td>Use in step 3.11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-5-MTS</td>
			<td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td>
			<td>G441000</td>
			<td>Use in step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators</td>
			<td>Sartorius, Inc.</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Broad Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26630</td>
			<td>Use in step 3.7, 3.10 and 3.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5053-01</td>
			<td>Use in step 3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Use in step 3.14.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Use in step 5.2 and 5.5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins

تفاعل stromal جزيء-1 (STIM1) نوع--أنا transmembrane البروتين الموجود على هيولى (ER) وأغشية البلازما (بعد الظهر). STIM1 ER-المقيم ينظم نشاط قنوات Orai1 م في عملية تعرف باسم مخزن الإدخال تعمل الكالسيوم (Ca2 +) الذي هو الرئيسي Ca2 + مما يشير إلى العملية التي تقود الاستجابة المناعية. يخضع STIM1 نبوستترانسلاشونال-جليكوسيليشن في موقعين Asn لومينال ضمن Ca2 + الاستشعار عن المجال للجزيء. ومع ذلك، الكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية، والآثار البيولوجية هيكل من N-الغليكوزيلاتي STIM1 كانت غير مفهومة حتى مؤخرا بسبب عدم القدرة على سهولة الحصول على مستويات عالية من البروتين-الغليكوزيلاتي نمتجانسة. وهنا يصف لنا التنفيذ في المختبر الكيميائي النهج الذي تولي مويتيس الجلوكوز لمواقع البروتين محددة تنطبق على فهم آثار N-جليكوسيليشن الكامنة في بنية البروتين وآلية. استخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الحل نقوم بتقييم كفاءة كلا من التعديل، فضلا عن عواقب الهيكلي المرفق الجلوكوز مع عينة واحدة. هذا النهج يمكن تكييفها مع سهولة لدراسة البروتينات الغليكوزيلاتي العديدة الموجودة في الطبيعة.

الخطوة الأولى من هذا النهج يتطلب الطفرات مخلفات glycosylation المرشح لبقايا Cys التي يمكن أن تكون قابلة للتعديل باستخدام أفسام الجلوكوز-5-mts. قد لا توجد بقايا Cys الذاتية، حيث لا توجد اعتبارات خاصة بحاجة إلى بذل قبل الطفرات. بيد يجب أن تحور أصلي Cys بقايا لبقايا غير قابلة للتعديل قبل ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

استهداف ثيولس سيستين في المختبر جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف

التحليلات الكيميائية الحيوية والهيكلية للبروتينات الغليكوزيلاتي تتطلب كميات كبيرة نسبيا من عينات متجانسة. وهنا نقدم طريقة كيميائية فعالة جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف تنقيته من البكتيريا باستهداف رد الفعل Cys ثيولس.

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

التعبير عن المؤتلف وظيفية راصة دموية والبروتينات النورامينيداز من الفيروسات الأنفلونزا H7N9 رواية باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

رصد الجمعية ليفرز البكتيرية الفوعة عن طريق عامل يشابك بمواقع محددة

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

الفئران اللمفاويات وسمها من قبل<sup&gt; 64</sup&gt; النحاس والأجسام المضادة مستقبلات استهداف ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الاتجار خلية بواسطة PET / ط م

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

في طرق المختبر لمقارنة الهدف وتجليد وCDC التعريفي بين الأجسام المضادة العلاجية: تطبيقات في تحليل Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

توليد نواقل هربس إنفلونزا الطيور المؤتلف مع كريسبر/Cas9 الجينات تحرير

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

فصل البشرة الجرذ والأدمة مع Thermolysin للكشف عن موقع محدد الحمض النووي الريبي الالتهابي والبروتين

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...