Name: targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

Cette recherche a été financée par les Sciences naturelles et l’ingénierie Conseil de recherches du Canada (05239 à PBS), la Fondation canadienne pour l’Innovation de l’Ontario Research Fund (à PBS), la Prostate Cancer Foundation Fight - Telus Ride for Dad (à PBS) et de l’Ontario Bourses d’études supérieures (à Y.J.C. et n.-é).

1. réaction en chaîne par polymérase (PCR)-médiée par mutagénèse dirigée pour l’incorporation de Cys dans un vecteur d’expression bactérienne pET-28 a.
<ol><li>Déterminer la concentration du vecteur animal-28 a (c'est-à-dire ADN bicaténaire) en utilisant un coefficient d’extinction ultraviolet (UV) de 0,020 (μg/mL) cm -1 à 260 nm.</li>
	<li>Synthétiser une paire d’amorces mutagéniques complémentaires pour chaque mutation Cys telle j’ai) il y a un minimum de 15 nucléotide...

Glycosylation des protéines est une modification post-traductionnelle où les sucres sont covalente aux polypeptides principalement par le biais de liens avec des chaînes latérales d’acides aminés. Jusqu'à 50 % de protéines de mammifères sont glycosylés 54, où les protéines glycosylées peuvent avoir par la suite une gamme variée d’effets de dérégler l’affinité de liaison biomoléculaire, influençant la protéine pliage, altérant l’activité du canal, ciblage molécules de ...

Stocker les exploités de calcium (Ca2 +) entrée (SOCE) est la principale voie par laquelle les cellules immunitaires prennent Ca2 + de l’espace extracellulaire dans le cytosol. Dans les lymphocytes T, lymphocytes T récepteurs situés sur la membrane plasmique (PM) lient antigènes qui activent la protéine-tyrosine kinases (évaluées à 1,2,3). Une cascade de phosphorylation entraîne l’activation de la phospholipase-γ (PLCγ) qui intervient par la suite dans l’hydrolyse de la membrane phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) en diacylglycérol et inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 ). IP3 est un petit Messager diffusible qui se lie aux IP3 récepteurs (IP3R) sur le réticulum endoplasmique (re) ainsi ouvrir ce canal récepteur et permis Ca2 + s’écouler dans le gradient de concentration de l’ER Lumen dans le cytosol (évaluée à 4). Signalisation des protéines G couplées et récepteurs à tyrosine kinase dans une variété d’autre cellules excitables et non-excitables types plomb pour la même production d’IP3 et l’activation des IP3Rs de récepteur.
En raison de la Ca2 + stockage capacité finie de l’urgence, l’IP3-communiqué de la médiation et augmentation résultante cytosolique Ca2 + est seulement transitoire ; Toutefois, cette diminution de l’ER luminale Ca2 + effets profondément stromales interaction molécule-1 (STIM1), un type-je transmembranaires (TM) protéines surtout présents sur la membrane de ER 5,6,7. STIM1 contient un lumen orienté Ca2 + détection domaine composé d’une paire de main EF et du α-motif (EFSAM). Coiled-coil de cytosolique axé sur trois domaines sont séparés des EFSAM par le seul domaine de TM (évaluée à 8). Sur ER luminale Ca2 + l’appauvrissement, EFSAM subit une oligomérisation couplés déstabilisation 7,9 , qui provoque des réarrangements structuraux de la TM et domaines coiled-coil 10. Ces changements structurels aboutissent à un piégeage de STIM1 ER-PM jonctions 11,12,13,14 , grâce à des interactions avec les PM phosphoinositides 15, 16 et Orai1 sous-unités 17,18. Orai1 protéines sont les sous-unités de PM qui assemblent pour former Ca2 + canaux 19,20,21,22. Les interactions de STIM1-Orai1 au niveau des jonctions ER-PM facilitent une Ca2 + déblocage activé Ca2 + (CRAC) canal conformation ouverte qui permet le mouvement de Ca2 + dans le cytosol de la concentration élevée de la espace extracellulaire. Dans les cellules immunitaires, les soutenue cytosolique Ca2 + élévations via les canaux CRAC induisent la Ca2 +- calmoduline/calcineurine dépendante déphosphorylation du facteur nucléaire des lymphocytes T activés qui par la suite entre le noyau et commence la régulation transcriptionnelle des gènes favorisant l’activation de lymphocytes T 1,3. Le processus d’activation canal CRAC par STIM1 23,24 via induite par l’agoniste ER luminale Ca2 + l’appauvrissement et la résultante soutenue cytosolique Ca2 + élévation est collectivement appelé SOCE 25. Le rôle vital de SOCE en lymphocytes T est évident par les études qui ont démontré que des mutations héréditaires dans les STIM1 et les Orai1 peuvent causer des déficit immunitaire combiné sévère syndromes 3,19,26, 27. EFSAM initie SOCE après détection ER-luminale Ca2 + épuisement par la perte de Ca2 + coordination à la main EF canonique, conduisant finalement à la déstabilisation couplés auto-association 7, 28,,29.
La glycosylation est la covalente et la transformation des structures oligosaccharide, également connu sous le nom de glycanes, à travers différentes étapes biosynthétiques de l’ER et Golgi (évaluée à 30,32,,33). Il existe deux types prédominants de glycosylation chez les eucaryotes : N-liés et O-liée, selon les acides aminés spécifiques et l’atome de la liaison de raccordement. Dans la N- glycosylation, glycanes sont attachés à l’amide de chaîne latérale de l’Asn, et dans la plupart des cas, l’étape d’initiation se produit dans la salle d’urgence comme le polypeptide chaîne se déplace dans le lumen 34. La première étape de la N- glycosylation est le transfert d’une structure de base de quatorze-sucre composé de glucose (Glc), mannose (Man) et N- acétylglucosamine (GlcNAc) (c.-à-d. Glc3Man9GlcNAc2) de l’ER membrane lipidique par un oligosaccharyltransferase 35,36. Des mesures supplémentaires, telles que le clivage ou le transfert des résidus de glucose, sont catalysées aux urgences par des glycosyltransférases et glycosidases spécifiques. Certaines protéines qui quittent la salle d’urgence et passer dans l’appareil de Golgi peuvent être encore transformés 37. O- glycosylation se réfère à l’ajout des glycanes, habituellement au groupe hydroxyle côté chaîne de résidus Ser ou Thr, et cette modification a été apportée tout à fait dans l’appareil de Golgi 33,34. Il y a plusieurs structures de O- glycanes qui peuvent être constitués de N- acétylglucosamine, fucose, galactose et l’acide sialique avec chaque monosaccharide ajouté séquentiellement 33.
Alors qu’aucune séquence spécifique n’a été identifié comme condition sine qua non pour de nombreux types de O- glycosylation, une séquence consensus commun a été associée avec le N-liée modification : Asn-X-Ser/Thr/Cys, où X peut être n’importe quel acide aminé sauf Pro 33. STIM1 EFSAM contient deux de ces sites de glycosylation - consensus N: Asn131-Trp132-Thr133 et Asn171-Thr172-Thr173. En effet, des études antérieures ont montré que EFSAM peut être N- glycosylées en cellules mammifères Asn131 et Asn171 38,39,40,41. Toutefois, des études antérieures des conséquences de la N- glycosylation sur SOCE ont été incongrues, suggérant supprimée, potentialise ou pas d’effet de cette modification post-traductionnelle SOCE activation 38,= « xref » > 39,40,41. Ainsi, la recherche sur les conséquences structurels, biochimiques et biophysiques sous-jacents de EFSAM N- glycosylation est essentielle pour comprendre les effets régulateurs de cette modification. En raison de l’exigence pour les niveaux élevés de protéines homogènes dans ces expériences in vitro , a appliqué une approche sélective des site pour attacher par covalence moitiés de glucose à EFSAM. Fait intéressant, Asn131 et Asn171 de glycosylation causé des changements structurels qui convergent dans le cœur EFSAM et d’améliorer les propriétés biophysiques qui favorisent la médiation STIM1 SOCE 42.
La fixation chimique du glycosyl groupes thiols Cys a été bien établie par un ouvrage qui tout d’abord démontré l’utilité de cette approche sans enzymes pour comprendre les effets propres au site de glycosylation sur protéine fonction 43 , 44. plus récemment et en ce qui concerne les STIM1, les résidus Asn131 et Asn171 ont été mutés à Cys et glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] a été utilisé de façon covalente lier glucose à thiols libres 42. Nous décrivons ici, cette approche qui non seulement utilise mutagénèse d’incorporer les résidus Cys spécifiques de site pour modification, mais s’applique également à spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) solution pour évaluer rapidement l’efficacité modification tant structurels perturbations suite à la glycosylation. Notamment, cette méthodologie générale est facilement adaptable pour étudier les effets de l' O- ou N- glycosylation d’une inoculation produit protéique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Use in step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1163</td>
			<td>Use in step 1.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>R0176</td>
			<td>Use in step 1.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presto Mini Plasmid Kit</td>
			<td>GeneAid, Inc.</td>
			<td>PDH300</td>
			<td>Use in step 1.16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>230280</td>
			<td>Use in step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli</td>
			<td>Invitrogen, Inc.</td>
			<td>18265017</td>
			<td>Use in step 1.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm Syringe Filter</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Use in step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88221</td>
			<td>Use in step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,500 Da MWCO Dialysis Tubing</td>
			<td>BioDesign, Inc.</td>
			<td>D306</td>
			<td>Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Thrombin</td>
			<td>BioPharm Laboratories, Inc.</td>
			<td>SKU91-055</td>
			<td>Use in step 3.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5156-01</td>
			<td>Use in step 3.11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-5-MTS</td>
			<td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td>
			<td>G441000</td>
			<td>Use in step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators</td>
			<td>Sartorius, Inc.</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Broad Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26630</td>
			<td>Use in step 3.7, 3.10 and 3.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5053-01</td>
			<td>Use in step 3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Use in step 3.14.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Use in step 5.2 and 5.5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins

Stromale interaction molécule-1 (STIM1) est un type-j’ai une protéine transmembranaire située sur le réticulum endoplasmique (re) et la membrane plasmique (PM). STIM1 ER-résident réglemente l’activité des canaux PM Orai1 dans un processus connu comme stocker entrée de commande de calcium (Ca2 +) qui est le principal Ca2 + signalisation processus qui entraîne la réponse immunitaire. STIM1 subit post-traductionnelles N- glycosylation sur deux sites de crash luminales au sein du Ca2 + détection domaine de la molécule. Toutefois, la biochimiques, biophysiques, et effets biologiques structure des N- glycosylées STIM1 ont été mal compris jusqu'à ce que récemment en raison de l’incapacité d’obtenir facilement des niveaux élevés de homogène N- glycosylées protéine. Nous décrivons ici la mise en œuvre d’une approche in vitro chimique qui s’attache à moitiés de glucose aux sites de protéine spécifique applicables à la compréhension des effets sous-jacents de N- glycosylation sur le mécanisme et la structure des protéines. En utilisant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire de solution, nous évaluons les deux l’efficacité de la modification, ainsi que les conséquences structurelles de l’attachement de glucose avec un seul échantillon. Cette approche peut facilement être adaptée pour étudier les protéines glycosylées myriad trouvées dans la nature.

La première étape de cette approche nécessite la mutagénèse des résidus de glycosylation candidat aux résidus Cys qui peuvent être modifiables à l’aide de la EFSAM de glucose-5-MTS. n’a aucun résidu Cys endogènes, donc aucune des considérations particulières ne doivent être apportées avant la mutagenèse. Toutefois, les résidus Cys natives doivent être mutés aux résidus non modifiable avant d’effectuer la chimie décrite. Pour au minimum réaliser la structure nat...

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Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Ciblage des Thiols de cystéine pour in Vitro in situ Glycosylation des protéines recombinantes

Des analyses biochimiques et structurales des protéines glycosylées exigent des quantités relativement importantes des échantillons homogènes. Nous présentons ici une méthode chimique efficace pour in site glycosylation des protéines recombinantes purifiée à partir de bactéries en ciblant les réactifs Cys thiols.

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

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