Name: targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00
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इस अनुसंधान के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद (०५२३९ P.B.S.), अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन/ओंटारियो अनुसंधान कोष (P.B.S.), प्रोस्टेट कैंसर लड़ो फाउंडेशन-पिताजी के लिए Telus सवारी (P.B.S.) और ओंटारियो द्वारा समर्थित था स्नातक छात्रवृत्ति (Y.J.C. और एन के लिए) ।

1. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)-एक बैक्टीरियल पालतू-28a अभिव्यक्ति वेक्टर में Cys के शामिल करने के लिए मध्यस्थता साइट-निर्देशित mutagenesis. 
<ol> <li> पालतू-28a वेक्टर की एकाग्रता का निर्धारण (यानी डबल असहाय डीएनए) ०.०...

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन एक पोस्ट-शोधों संशोधन है जहां शर्करा एमिनो एसिड साइड चेन को लिंकेज के माध्यम से मुख्य रूप से polypeptides से जुड़ी covalently है । स्तनधारी प्रोटीन के रूप में कई के रूप में ५०% ग्लाइकोसिलेटेड <sup c...

स्टोर संचालित कैल्शियम (सीए2 +) प्रविष्टि (SOCE) प्रमुख मार्ग है जिसके द्वारा प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ले2 + extracellular अंतरिक्ष से cytosol में Ca । टी लिम्फोसाइटों में प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) बाँध एंटीजन पर स्थित टी सेल रिसेप्टर्स जो प्रोटीन tyrosine kinases को सक्रिय करते हैं ( 1,2,3) में समीक्षित । एक फास्फारिलीकरण झरना phospholipase के सक्रियकरण की ओर जाता है-γ (PLCγ) जो बाद में hydrolysis और phosphatidylinositol 1, 4, 5-bisphosphate में झिल्ली diacylglycerol 4, 5-inositol (रंज2) के trisphosphate मध्यस्थता (आईपी3 ). आईपी3 एक छोटी सी diffusible दूत जो आईपी3 रिसेप्टर्स (आईपी3आर) endoplasmic जालिका (एर) पर बांधता है जिससे इस रिसेप्टर चैनल खोलने और सीए2 + की अनुमति के लिए नीचे की ओर प्रवाह से एकाग्रता ढाल एर लुमेन को cytosol ( 4में समीक्षित) । जी प्रोटीन से संकेत रिसेप्टर युग्मित और अन्य उत्तेजित और गैर उत्तेजक कोशिका प्रकार की एक किस्म में tyrosine कळेनासे रिसेप्टर्स आईपी3 और आईपी के सक्रियकरण3रुपए का एक ही उत्पादन के लिए नेतृत्व.
के कारण परिमित ca2 + ईआर की भंडारण क्षमता, आईपी3-मध्यस्थता जारी है और cytosolic Ca में परिणामी वृद्धि2 + केवल क्षणिक है; हालांकि, एर चमकदार Ca के इस घट2 + निराधार प्रभाव stromal संपर्क अणु-1 (STIM1), एक प्रकार-I transmembrane (TM) प्रोटीन ज्यादातर एर झिल्ली 5पर पाया,6,7। एक EF-हाथ जोड़ी और बाँझ α-आकृति (EFSAM) से बना STIM1 एक लुमेन उंमुख सीए2 + संवेदन डोमेन शामिल हैं । तीन cytosolic-उंमुख कुंडलित डोमेन एकल TM डोमेन द्वारा EFSAM से अलग कर रहे है ( 8में समीक्षित) । एर पर चमकीले Ca2 + कमी, EFSAM एक स्थिरीकरण-oligomerization 7युग्मित,9 जो TM और कुंडलित-कुंडल डोमेन 10के संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था का कारण बनता है । ये संरचनात्मक परिवर्तन एर-पीएम जंक्शनों 11,12,13,14 में STIM1 के एक फँसाने में महायुद्ध के साथ बातचीत के माध्यम से phosphoinositides 15, 16 व Orai1 उपइकाईयां 17,18. Orai1 प्रोटीन पीएम उपइकाई है जो सीए2 + चैनल 19,20,21,22के रूप में इकट्ठा कर रहे हैं । एर-पीएम जंक्शनों पर STIM1-Orai1 बातचीत एक खुले सीए की सुविधा2 + रिलीज़ सक्रिय ca2 + (CRAC) चैनल अनुरूपण जो के उच्च सांद्रता से cytosol में सीए2 + के आंदोलन को सक्षम बनाता है extracellular स्पेस. प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, निरंतर cytosolic ca2 + उंनयन CRAC चैनलों के माध्यम से प्रेरित सीए2 +-calmodulin/calcineurin निर्भर dephosphorylation के परमाणु कारक के सक्रिय टी कोशिकाओं जो बाद में नाभिक में प्रवेश करती है और टी सेल सक्रियकरण 1,3को बढ़ावा देने के जीन का transcriptional विनियमन शुरू होता है । STIM1 द्वारा CRAC चैनल सक्रियण की प्रक्रिया 23,24 के माध्यम से एगोनिस्ट-प्रेरित एर चमकदार ca2 + घट और परिणामस्वरूप निरंतर cytosolic ca2 + ऊंचाई सामूहिक रूप से 25SOCE है । टी कोशिकाओं में SOCE की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन अध्ययनों से स्पष्ट है कि दोनों STIM1 और Orai1 में heritable उत्परिवर्तनों गंभीर संयुक्त इम्यूनो सिंड्रोम पैदा कर सकता है 3,19,26, 27. EFSAM आरंभ करता है SOCE संवेदन के बाद एर-चमकदार सीए2 + समाप्त ca के नुकसान के माध्यम से2 + विहित EF-हाथ में समंवय, अंततः स्थिरीकरण के लिए अग्रणी-युग्मित स्वयं-संघ 7, २८,२९.
ग्लाइकोसिलेशन आबंध लगाव और oligosaccharide संरचनाओं के प्रसंस्करण, भी glycans के रूप में जाना जाता है, एर और Golgi में विभिंन प्रकार के कृत्रिम कदम के माध्यम से ( 30में समीक्षा की गई है,३२,३३) । eukaryotes में ग्लाइकोसिलेशन के दो प्रमुख प्रकार हैं: एन-लिंक्ड और ओ-लिंक्ड, विशिष्ट अमीनो एसिड और लिंकेज को पाटने वाले एटम पर निर्भर करता है । N-ग्लाइकोसिलेशन में, glycans Asn के बीच पक्ष श्रृंखला से जुड़े रहे हैं, और ज्यादातर मामलों में, दीक्षा कदम पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला लुमेन ३४में चलता है के रूप में ईआर में होता है । N-ग्लाइकोसिलेशन का पहला कदम एक चौदह चीनी कोर संरचना ग्लूकोज (Glc), mannose (आदमी), और एन-acetylglucosamine (GlcNAc) (यानी Glc3आदमी9GlcNAc2) एक एर से बना के हस्तांतरण है झिल्ली लिपिड एक oligosaccharyltransferase ३५,३६द्वारा । इसके अलावा कदम, जैसे दरार या ग्लूकोज के अवशेषों का हस्तांतरण, ईआर में विशिष्ट glycosidases और glycosyltransferases द्वारा catalyzed हैं । कुछ प्रोटीन है कि एर छोड़ और Golgi में कदम आगे ३७संसाधित किया जा सकता है । ओ-ग्लाइकोसिलेशन glycans के अलावा करने के लिए संदर्भित करता है, आम तौर पर पक्ष श्रृंखला हाइड्रॉक्सिल समूह Ser या के अवशेषों के लिए, और इस संशोधन Golgi परिसर में पूरी तरह से होता है ३३,३४. वहां कई ओglycan संरचनाओं जो N-acetylglucosamine, fucose, गैलेक्टोज, और sialic एसिड प्रत्येक monosaccharide के साथ बनाया जा सकता है क्रमिक रूप से ३३जोड़ा ।
कई प्रकार के O-ग्लाइकोसिलेशन के लिए कोई विशिष्ट अनुक्रम शर्त के रूप में पहचाना गया है, जबकि N-लिंक किए गए संशोधन के साथ एक आम सहमति अनुक्रम संबद्ध किया गया है: Asn-x-Ser/Cys, जहां x किसी भी एमिनो एसिड हो सकता है सिवाय प्रो ३३। STIM1 EFSAM में इनमें से दो आम सहमत हैं N-ग्लाइकोसिलेशन साइटें: Asn131-Trp132-Thr133 और Asn171-Thr172-Thr173. दरअसल, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि EFSAM में Asn131 और Asn171 ३८,३९,४०,४१पर स्तनधारी कोशिकाओं में एन-ग्लाइकोसिलेटेड हो सकता है । हालांकि, SOCE पर N-ग्लाइकोसिलेशन के परिणामों के पिछले अध्ययनों को incongruent गया है, SOCE सक्रियण पर इस पोस्ट-शोधों संशोधन द्वारा दबा, potentiated या कोई प्रभाव नहीं सुझाया गया है ३८,= "xref" > 39,४०,४१. इस प्रकार, अंतर्निहित भौतिक, जैव रासायनिक, और EFSAM N-ग्लाइकोसिलेशन के संरचनात्मक परिणामों पर अनुसंधान इस संशोधन के विनियामक प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । इन इन विट्रो प्रयोगों में सजातीय प्रोटीन के उच्च स्तर के लिए आवश्यकता के कारण, एक साइट-चुनिंदा covalently करने के लिए moieties संलग्न करने के लिए दृष्टिकोण ग्लूकोज EFSAM करने के लिए लागू किया गया था । दिलचस्प है, Asn131 और Asn171 ग्लाइकोसिलेशन संरचनात्मक परिवर्तन है कि EFSAM कोर के भीतर एकाग्र और जो STIM1-मध्यस्थता SOCE ४२को बढ़ावा देने के लिए भौतिक गुणों को बढ़ाने के कारण ।
Cys thiols करने के लिए glycosyl समूहों के रासायनिक लगाव अच्छी तरह से किया गया है एक प्राथमिक काम है जो पहली बार इस एंजाइम की उपयोगिता-मुक्त दृष्टिकोण को समझने के लिए साइट-प्रोटीन समारोह पर ग्लाइकोसिलेशन के विशिष्ट प्रभावों का प्रदर्शन द्वारा स्थापित ४३ , ४४. हाल ही में और STIM1 के संबंध में, Asn131 और Asn171 अवशेषों Cys और ग्लूकोज-5-(methanethiosulfonate) [ग्लूकोज-5-(MTS)] के लिए रूपांतरित हो गए थे covalently लिंक करने के लिए ग्लूकोज मुक्त thiols ४२करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यहां, हम इस दृष्टिकोण का वर्णन है जो न केवल संशोधन के लिए साइट विशिष्ट Cys अवशेषों को शामिल mutagenesis का उपयोग करता है, लेकिन यह भी समाधान परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी तेजी से दोनों संशोधन दक्षता और संरचनात्मक का आकलन करने के लिए लागू होता है perturbations के फलस्वरूप ग्लाइकोसिलेशन । विशेष रूप से, यह सामांय पद्धति आसानी से किसी भी recombinantly उत्पादित प्रोटीन का या तो O-या N-ग्लाइकोसिलेशन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलनीय है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Use in step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1163</td>
			<td>Use in step 1.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>R0176</td>
			<td>Use in step 1.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presto Mini Plasmid Kit</td>
			<td>GeneAid, Inc.</td>
			<td>PDH300</td>
			<td>Use in step 1.16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>230280</td>
			<td>Use in step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli</td>
			<td>Invitrogen, Inc.</td>
			<td>18265017</td>
			<td>Use in step 1.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm Syringe Filter</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Use in step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88221</td>
			<td>Use in step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,500 Da MWCO Dialysis Tubing</td>
			<td>BioDesign, Inc.</td>
			<td>D306</td>
			<td>Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Thrombin</td>
			<td>BioPharm Laboratories, Inc.</td>
			<td>SKU91-055</td>
			<td>Use in step 3.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5156-01</td>
			<td>Use in step 3.11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-5-MTS</td>
			<td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td>
			<td>G441000</td>
			<td>Use in step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators</td>
			<td>Sartorius, Inc.</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Broad Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26630</td>
			<td>Use in step 3.7, 3.10 and 3.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5053-01</td>
			<td>Use in step 3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Use in step 3.14.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Use in step 5.2 and 5.5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins

Stromal इंटरेक्शन अणु-१ (STIM1) एक प्रकार है-I transmembrane प्रोटीन endoplasmic जालिका (ER) और प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) पर स्थित है । एर निवासी STIM1 एक दुकान के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में पीएम Orai1 चैनलों की गतिविधि को विनियमित कैल्शियम (सीए2 +) प्रवेश जो प्रिंसिपल सीए2 + संकेतन प्रक्रिया है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ड्राइव. STIM1 के बाद दो चमकीले Asn स्थलों पर ग्लाइकोसिलेशन का बहोत ही 2 + अणु का सेंसिंग डोमेन है । हालांकि, जैव रासायनिक, भौतिक, और संरचना एनके जैविक प्रभाव-ग्लाइकोसिलेटेड STIM1 हाल ही में एक को आसानी से सजातीय N-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए अक्षमता की वजह से समझ रहे थे । यहां, हम एक इन विट्रो रासायनिक दृष्टिकोण है जो विशिष्ट प्रोटीन के अंतर्निहित प्रभाव को समझने के लिए लागू करने के लिए ग्लूकोज moieties देता है के कार्यांवयन का वर्णन एनप्रोटीन संरचना और तंत्र पर ग्लाइकोसिलेशन । समाधान परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग हम संशोधन की दोनों दक्षता के साथ ही एक नमूना के साथ ग्लूकोज लगाव के संरचनात्मक परिणामों का आकलन. इस दृष्टिकोण आसानी से प्रकृति में पाया असंख्य ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस दृष्टिकोण के पहले चरण के लिए उंमीदवार ग्लाइकोसिलेशन अवशेषों Cys अवशेषों जो ग्लूकोज-5-MTS. EFSAM का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है के लिए mutagenesis की आवश्यकता है कोई अंतर्जात Cys अवशेषों, तो कोई विशेष ?...

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Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

लक्ष्यीकरण Cysteine Thiols के लिए इन विट्रो साइट-संयोजक प्रोटीन के विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन

ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के जैव रासायनिक और संरचनात्मक विश्लेषण सजातीय नमूनों की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है । यहां, हम साइट के लिए एक कुशल रासायनिक विधि वर्तमान संयोजक प्रोटीन के विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन प्रतिक्रियाशील Cys thiols लक्ष्यीकरण द्वारा बैक्टीरिया से शुद्ध ।

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

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