Name: targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

Denna forskning stöddes av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada (05239 till PBS), kanadensiska Institutet för Innovation/Ontario forskningsfond (till PBS), prostata Cancer slåss Foundation - Telus Ride för pappa (till PBS) och Ontario Graduate stipendium (till Y.J.C. och N.S.).

1. polymeras-kedjereaktion (PCR)-medierad webbplats riktad mutagenes för införlivandet av Cys i en bakteriell pET-28a uttryck vektor.
<ol><li>Bestämma koncentrationen av pET-28a vektorn (dvs dubbel stranded DNA) med en ultraviolett (UV) extinktionskoefficient 0,020 (μg/mL) cm -1 vid 260 nm.</li>
	<li>Syntetisera ett par kompletterande mutagena primers för varje Cys mutation sådan att jag) finns det minst 15 nukleotider kompletterar mallen innan första bas obalansen och 15 nukleotider komplet...

Protein glycosylation är en post-translationella ändring där socker är kovalent kopplade till polypeptider främst genom kopplingar till aminosyra sida kedjor. Så många som 50% av protein från däggdjur är glykosylerat 54, där glykosylerat proteinerna kan därefter ha ett varierat utbud av effekter från att ändra Biomolekylär affinitet, påverka protein vikning, att ändra kanal verksamhet, inriktning molekyler för nedbrytning och cellulära människohandel, för att nämna några (ö...

Lagra manövrerade kalcium (Ca2 +) post (SOCE) är den huvudsakliga vägen som immunceller tar upp Ca2 + från extracellulära i cytosolen. I T-lymfocyter binder T-cellreceptorer ligger på plasmamembranet (PM) antigenerna som aktivera proteinet tyrosinkinas (ses i 1,2,3). En fosforylering kaskad leder till aktivering av fosfolipas-γ (PLCγ) som därefter förmedlade hydrolys av membran fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) till diglyceridolja och inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3 ). IP3 är en liten diffusible budbärare som binder till IP-3 receptorer (IP3R) på det endoplasmatiska retiklet (ER) därmed öppna denna receptor kanal och tillåter Ca2 + att rinna ner koncentrationsgradient från akuten lumen till cytosolen (ses i 4). Receptorn signalering från G-protein kopplade och tyrosin Kinas receptorer i en mängd andra hetsiga och icke-retbara cell typer bly på samma produktion av IP3 och aktivering av IP3Rs.
På grund av ändliga Ca2 + lagringskapaciteten av ER, IP-3-medierad release och resulterande ökning cytosoliska Ca2 + är endast övergående; emellertid, denna utarmning av den ER luminala Ca2 + djupt effekter stromal interaktion celladhesionsmolekyl-1 (STIM1), en typ-jag transmembrana (TM) protein som mestadels finns på ER membran 5,6,7. STIM1 innehåller en lumen-orienterade Ca2 + fjärranalys domän består av en EF-hand par och sterila α-motiv (EFSAM). Tre cytosoliska-orienterade dubbeltvinnade domäner skiljs från EFSAM genom den enda TM domänen (över 8). Vid ER luminala Ca2 + utarmning genomgår EFSAM en destabilisering-kopplade oligomerisering 7,9 som orsakar strukturella rearrangements av TM och dubbeltvinnade domäner 10. Dessa strukturella förändringar kulminera i en svällning av STIM1 ER-PM korsningar 11,12,13,14 genom interaktioner med PM phosphoinositides 15, 16 och Orai1 subenheter 17,18. Orai1 proteiner är PM subunitsna som monterar till form Ca2 + kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 interaktioner i ER-PM korsningar underlätta en öppen Ca2 + release aktiveras Ca2 + (CRAC) kanal konformation som möjliggör förflyttning av Ca2 + till cytosolen från de höga koncentrationerna av den extracellulära. I immunceller, den ihållande cytosoliska Ca2 + förhöjt via CRAC kanaler inducera de Ca2 +- calmodulin/kalcineurin beroende Defosforylering av nuclear factor av aktiverade T-celler som därefter in i kärnan och börjar Transkriptionsreglering av gener att främja T-cells aktivering 1,3. Processen för CRAC kanal aktivering av STIM1 23,24 via agonist-inducerad ER luminala Ca2 + utarmning och den resulterande ihållande cytosoliska Ca2 + höjden kallas kollektivt SOCE 25. SOCE i T-cellerna vitala roll framgår av studier som visar att ärftliga mutationer i både STIM1 och Orai1 kan orsaka svår kombinerad immunbrist syndrom 3,19,26, 27. EFSAM initierar SOCE efter avkänning ER-luminala Ca2 + utarmning via förlust av Ca2 + samordning på den kanoniska EF-handen, vilket slutligen leder till destabilisering-kopplade själv association 7, 28,29.
Glycosylation är kovalent fastsättning och bearbetning av oligosackarid strukturer, även känd som glycans, genom olika biosyntetiska stegen i ER och Golgi (över 30,32,33). Det finns två dominerande typer av glycosylation i Eukaryoter: N-länkade och O-kopplad, beroende på specifik aminosyra och atom överbrygga kopplingen. I N- glycosylation, glycans är kopplade till den side chain amiden av Asn, och i de flesta fall uppstår det inledande steget i ER som polypeptiden kedjan flyttar in i lumen 34. Det första steget av N- glycosylation är överföring av en fjorton-socker kärna struktur består av glukos (Glc), mannos (Man) och N- acetylglukosamin (GlcNAc) (dvs Glc3Man9GlcNAc2) från en ER membran lipider av en oligosaccharyltransferase 35,36. Ytterligare steg, exempelvis klyvning eller överföring av glukos rester, är katalyseras i ER av specifika glycosidases och glykosyltransferaser. Vissa proteiner som lämnar ER och flytta in i Golgi kan finnas ytterligare bearbetade 37. O- glycosylation avser tillägg av glycans, oftast till side chain hydroxylgruppen Ser eller Thr resthalter, och denna ändring sker helt i den Golgi komplex 33,34. Det finns flera O- glycan strukturer som kan bestå av N- acetylglukosamin, fukos, galaktos och sialic acid med varje monosackarid lagt till sekventiellt 33.
Medan ingen specifik sekvens har identifierats som förutsättning för många typer av O- glycosylation, en gemensam samsyn sekvens har associerats med N-länkade modifiering: Asn-X-Ser/Thr/Cys, där X kan vara någon aminosyra Förutom Pro 33. STIM1 EFSAM innehåller två av dessa samförstånd N- glycosylation platser: Asn131-Trp132-Thr133 och Asn171-Thr172-Thr173. Tidigare studier har faktiskt visat att EFSAM kan vara N- glykosylerat i däggdjursceller vid Asn131 och Asn171 38,39,40,41. Men tidigare studier av konsekvenserna av N- glycosylation på SOCE har inkonsekvens, vilket tyder på undertryckt, betablockerare eller ingen effekt av denna posttranslationella modifieringen på SOCE aktiveringen 38,= ”xref” > 39,40,41. Forskning om underliggande biofysiska, biokemiska och strukturella konsekvenser av EFSAM N- glycosylation är således mycket viktigt att begripa de rättsliga effekterna av denna ändring. På grund av kravet på för höga nivåer av homogena proteiner i dessa in vitro- experiment tillämpades en webbplats-selektiv strategi att fästa kovalent glukosenheter EFSAM. Intressant, orsakade Asn131 och Asn171 glycosylation strukturella förändringar som konvergerar inom den EFSAM kärnan och öka biofysiska egenskaper som främjar STIM1-medierad SOCE 42.
Kemisk fastsättning av glycosyl grupper till Cys tioler har varit väl etablerade av ett banbrytande arbete som först visat nyttan av detta enzym-fri sätt att förstå glycosylation platsspecifika effekter på protein funktion 43 , 44. mer nyligen och med avseende på STIM1, Asn131 och Asn171 rester var muterat till Cys och glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] användes kovalent länka glukos till gratis tioler 42. Här, beskriver vi detta synsätt som inte bara använder mutagenes för att införliva specifika Cys restmängder för modifiering, men gäller även lösning kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi för att snabbt bedöma både modifiering effektivitet och struktur störningar till följd av glycosylation. Noterbart här allmän metod är lätt anpassningsbar för att studera effekterna av antingen O- eller N- glycosylation någon recombinantly produceras protein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Use in step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1163</td>
			<td>Use in step 1.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>R0176</td>
			<td>Use in step 1.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presto Mini Plasmid Kit</td>
			<td>GeneAid, Inc.</td>
			<td>PDH300</td>
			<td>Use in step 1.16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>230280</td>
			<td>Use in step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli</td>
			<td>Invitrogen, Inc.</td>
			<td>18265017</td>
			<td>Use in step 1.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm Syringe Filter</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Use in step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88221</td>
			<td>Use in step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,500 Da MWCO Dialysis Tubing</td>
			<td>BioDesign, Inc.</td>
			<td>D306</td>
			<td>Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Thrombin</td>
			<td>BioPharm Laboratories, Inc.</td>
			<td>SKU91-055</td>
			<td>Use in step 3.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5156-01</td>
			<td>Use in step 3.11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-5-MTS</td>
			<td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td>
			<td>G441000</td>
			<td>Use in step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators</td>
			<td>Sartorius, Inc.</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Broad Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26630</td>
			<td>Use in step 3.7, 3.10 and 3.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5053-01</td>
			<td>Use in step 3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Use in step 3.14.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Use in step 5.2 and 5.5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins

Stromaceller interaktion celladhesionsmolekyl-1 (STIM1) är en typ-jag transmembrane protein ligger på endoplasmatiska nätverket (ER) och plasma membran (PM). ER-resident STIM1 reglerar aktiviteten av PM Orai1 kanaler i en process som kallas lagra manövrerade kalcium (Ca2 +) inträde som är huvudsakliga Ca2 + signalering processen som driver immunsvaret. STIM1 genomgår posttranslationella N- glycosylation på två luminala Asn platser inom Ca2 + fjärranalys domänen av molekylen. Dock den biokemiska, biofysiska, och struktur biologiska effekter av N- glykosylerat STIM1 förstods dåligt tills nyligen på grund av en oförmåga att lätt få höga halter av homogena N- glykosylerat protein. Här, beskriver vi genomförandet av ett in vitro- kemiska tillvägagångssätt som tillmäter specifikt protein platser gäller att förstå underliggande inverkan på Proteiners struktur och mekanism av N- glycosylation glukosenheter. Med hjälp av lösning kärnmagnetisk resonansspektroskopi bedöma vi både effektiviteten av ändringen samt de strukturella konsekvenserna av glukos tillbehöret med ett enda prov. Detta tillvägagångssätt kan lätt anpassas för att studera de otaliga glykosylerat proteiner som finns i naturen.

Det första steget i detta tillvägagångssätt kräver mutagenicitet av kandidat glycosylation rester till Cys resthalter som kan vara modifierbara använder den glukos-5-MTS. EFSAM har inga endogena Cys-rester, så inga särskilda överväganden måste göras före den mutagenes. Infödda Cys rester måste dock vara muterat till icke-ändringsbara rester innan du utför beskrivs kemi. För att minimalt effekt infödda struktur, föreslår vi att utföra en global ordning justering av pr...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Inriktning cystein tioler för in Vitro platsspecifika Glycosylation av rekombinanta proteiner

Biokemiska och strukturella analyser av glykosylerat proteiner kräver relativt stora mängder homogena prover. Här presenterar vi en effektiv kemisk metod för platsspecifika glycosylation av rekombinanta proteiner renas från bakterier genom att rikta reaktiva Cys tioler.

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Uttryck av Functional rekombinant hemagglutinin och neuraminidas Proteiner från Novel H7N9 influensavirus Använda baculovirusexpressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murina Lymfocyt Märkning av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antikroppreceptor Targeting för<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Trafficking med PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System för Efficacy och cytotoxicitet Screening av inhibitorer Inriktning Intracellulär<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder för att jämföra målbindning och CDC-induktion mellan terapeutiska antikroppar: applikationer i biosimilaritetsanalys

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generera rekombinant aviär Herpesvirus vektorer med CRISPR/Cas9 gen redigering

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Separation av Råtta Epidermis och Dermis med Thermolysin för att upptäcka platsspecifik inflammatorisk mRNA och protein

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...