Name: targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

Bu araştırma Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (PBS için 05239), Kanada Vakfı tarafından desteklenmiştir yenilik/Ontario Araştırma Fonu (PBS için) prostat kanseri Vakfı - babama (PBS) ve Ontario Telus gezintiye mücadele Yüksek Lisans Burs (Y.J.C. ve NS).

1. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR)-site yönettiği mutagenesis Cys birleşme bir bakteriyel evde beslenen hayvan-28a ifade vektör içine aracılı.
<ol><li>260 0,020 (μg/mL) cm -1 ultraviyole (UV) nesli katsayısı kullanarak evde beslenen hayvan-28a vektör (Yani çift iplikçikli DNA) konsantrasyonu belirlemek nm.</li>
	<li>Sentez böyle her Cys mutasyon için tamamlayıcı mutajenik astar bir çift ben) tamamlayıcı ilk Bankası uyuşmazlığı ve 15 nukleotid sonra şablonu için tamamlay?...

Protein glikozilasyon nerede şekerler kovalent polipeptitler öncelikle amino asit yan zincirlerine bağlantıları aracılığıyla eklenen post-translational bir değişiklik olduğunu. Memeli proteinler en çok % 50'si olan glikozile 54, glikozile proteinler daha sonra biyomoleküler bağlama benzeşme değiştirme gelen etkileri çeşitli bir yelpazede içebileceğiniz, katlama, kanal etkinlik değiştirerek, hedefleme protein etkileyen molekülleri bozulması ve hücresel, devletlerde (<sup ...

İşletilen kalsiyum (Ca2 +) depolamak girişidir (SOCE) hangi tarafından bağışıklık hücreleri almak Ca2 + sitozol ekstraselüler uzaya üzerinden büyük yol. T lenfositler, plazma zarı (PM) yer alan T hücre reseptör protein tirozin kinaz ( 1,2,3' te gözden) etkinleştirmek antijenleri bağlayın. Bir fosforilasyon çağlayan fosfolifaz-γ (PLCγ) hangi daha sonra diacylglycerol ve inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 membran phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) hidroliz aracılık eder aktivasyonu yol açar ). IP3 konsantrasyon degrade acil servis üzerinden aşağı akmaya böylece bu reseptör kanal açma ve Ca2 + izin IP3 için (IP3R) üzerinde reseptörleri endoplazmik retikulum (ER) bağlayan bir küçük diffusible elçisidir Lümen ( 4' te gözden) sitozol için. Reseptör birleştiğinde gr protein ve tirozin kinaz reseptörleri başka bir heyecanlı ve telaşlı hücre türleri sorumlu çeşitli IP3 aynı üretim ve IP3Rs aktivasyonu için sinyal.
Sonlu Ca2 + depolama kapasitesini ER, IP3nedeniyle-aracılı yayın ve sonuç artış sitozolik Ca2 + sadece geçici; Bununla birlikte, bu tükenmesi ER luminal Ca2 + derinden stromal etkileşim molekülü-1 (STIM1), bir tür etkiler-ben transmembran (TM) protein çoğunlukla üzerinde ER membran 5,6,7bulundu. STIM1 bir EF-el çift ve steril α-motifi (EFSAM) oluşan bir Lümen odaklı Ca2 + algılama etki alanı içerir. Üç sitozolik odaklı dolandı-coil etki alanı EFSAM ( 8' gözden) tek TM etki alanı tarafından ayrılır. ER luminal Ca2 + tükenmesi, yapısal düzenlemeler TM ve kıvrılmış-coil etki alanları 10neden bir istikrarsızlık birleştiğinde Oligomerizasyonda 7,9 EFSAM uğrar. Bu yapısal değişiklikler yayınlanmasından sonuçlanan bir bindirme STIM1 ER-PM kavşak 11,12,13,14 PM phosphoinositides 15, ile etkileşimleri aracılığıyla 16 ve Orai1 alt birimleri 17,18. Orai1 forma Ca2 + kanal 19,20,21,22araya PM alt birimleri proteinlerdir. STIM1-Orai1 etkileşimleri ER-PM kavşaklar, Ca2 + yüksek konsantrasyonda üzerinden sitozol içine hareketini sağlayan bir açık Ca2 + aktif yayın Ca2 + (CRAC) kanal uyum kolaylaştırmak Ekstrasellüler boşluk. Bağışıklık hücreleri içinde sürekli sitozolik Ca2 + yükselmeler CRAC kanalları üzerinden Ca2 +- calmodulin/kalsinörin bağımlı dephosphorylation daha sonra çekirdek girer nükleer faktör aktive T-hücrelerinin neden ve T-hücre harekete geçirmek 1,3teşvik genlerin transkripsiyon yönetmelik başlar. Agonist kaynaklı luminal Ca tükenmesi2 + ER via STIM1 23,24 ve elde edilen sürekli sitozolik Ca2 + yükseklik tarafından CRAC kanal etkinleştirme işlemi toplu olarak SOCE 25olarak adlandırılır. SOCE T-hücreleri hayati rol tarafından ağır kombine immün yetmezlik sendromları 3,19,26, STIM1 ve Orai1 kalıtsal mutasyonların neden olabilir gösteren çalışmalar belirgindir 27. EFSAM başlatır SOCE ER luminal Ca2 + tükenmesi kaybı ile Ca2 + koordinasyon kurallı EF-el, sonuçta kendi kendine Derneği istikrarsızlık birleştiğinde 7, önde gelen algılama sonra 28,29.
Glikozilasyon kovalent eki ve işleme oligosakkarit yapıları, olarak da bilinen glukanlardir, ER ve Golgi ( 30,32,33gözden) çeşitli biyosentetik adımlarda var. Glikozilasyon Ökaryotlar iki baskın tür vardır: N-bağlantılı ve O-bağlı, belirli amino asit ve bağlantı köprüleme atom bağlı olarak. N- glikozilasyon, glukanlardir Asn yan zinciri Amid için eklenir ve çoğu durumda, inisiyasyon adım serviste oluşur polipeptid zinciri Lümen 34taşır. Glikoz (Glc), mannoz (adam) ve N- peptidoglikan (GlcNAc) (yani Glc3Man9GlcNAc2) acil servise oluşur On dört-şeker çekirdek yapısı transferini N- glikozilasyon, ilk adımdır membran lipid oligosaccharyltransferase 35,36tarafından. Daha fazla adımlar, bölünme veya glikoz artıkları, transfer gibi acil serviste belirli glycosidases ve glycosyltransferases tarafından katalize. Acil servis bırakın ve Golgi hareket bazı proteinler daha fazla işlenmiş 37olabilir. Glukanlardir, genellikle Ser veya Thr artıkları, yan zinciri hidroksil grubu için ek O- glikozilasyon başvurduğu ve bu değişiklik tamamen Golgi kompleksi 33,34oluşur. Kadar yapılabilir N- peptidoglikan, fucose, galaktoz birkaç O- glycan yapıları ve sialik asit her yaşam ile sırayla 33ekledi.
Hiçbir belirli sıra adl tip-in O- glikozilasyon, için önkoşul olarak tanımlanan süre ortak bir fikir birliği sırası Nile ilişkili olduğu düşünülmektedir-bağlantılı değişiklik: Asn-X-Ser/Thr/nerede X-ebilmek var olmak herhangi bir amino asit Cys, Pro 33. STIM1 EFSAM iki bu fikir birliği N- glikozilasyon sitelerin içerir: Asn131-Trp132-Thr133 ve Asn171-Thr172-Thr173. Gerçekten de, önceki çalışmalar EFSAM N- glikozile 38,39,40,41Asn131 ve Asn171 memeli hücrelerinde olabilir göstermiştir. Ancak, N- glikozilasyon SOCE üzerinde sonuçları önceki çalışmalarda uyumsuz olmuştur, düşündüren bastırılmış, potentiated veya hiçbir etkisi bu translasyonel modifikasyon tarihinde SOCE harekete geçirmek 38, tarafından"xref" = > 39,40,41. Böylece, EFSAM N- glikozilasyon temel biyofiziksel, biyokimyasal ve yapısal sonuçları üzerinde araştırma bu değişiklik düzenleyici etkileri kavrama için hayati önem taşımaktadır. Bu vitro deneyler homojen proteinler yüksek düzeyde gereksinimini nedeniyle kovalent glikoz moieties için EFSAM eklemek için site seçici bir yaklaşım uygulandı. İlginçtir, Asn131 ve Asn171 glikozilasyon içinde EFSAM çekirdek yakınsama ve SOCE STIM1-aracılı 42teşvik biyofiziksel özellikleri geliştirmek yapısal değişiklikler nedeniyle.
Cys thiols kimyasal bağlanma glikosil gruplarının köklü tarafından ilk protein işlevi 43 siteye özgü glikozilasyon etkilerini anlamak için bu enzim-Alerjik yaklaşımın gösterdi seminal bir çalışma oldu , 44. son zamanlarda ve saygı ile STIM1, Asn131 ve Asn171 artıkları için Cys mutasyona uğramış ve glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] kovalent glikoz için ücretsiz thiols 42bağlamak için kullanıldı. Burada, biz sadece mutagenesis site belirli Cys artıkları değişiklik için birleştirmek için kullanır ama çözüm Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi hızla değişiklik verimliliği ve yapısal değerlendirmek için de geçerlidir bu yaklaşım tarif tedirginlikler glikozilasyon bir sonucu olarak. Özellikle, bu genel metodoloji ya O- etkileri çalışmaya kolayca uyarlanabilir veya N- glikozilasyon herhangi recombinantly protein üretilen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Use in step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1163</td>
			<td>Use in step 1.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>R0176</td>
			<td>Use in step 1.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presto Mini Plasmid Kit</td>
			<td>GeneAid, Inc.</td>
			<td>PDH300</td>
			<td>Use in step 1.16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>230280</td>
			<td>Use in step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5a E. coli</td>
			<td>Invitrogen, Inc.</td>
			<td>18265017</td>
			<td>Use in step 1.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mm Syringe Filter</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Use in step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88221</td>
			<td>Use in step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,500 Da MWCO Dialysis Tubing</td>
			<td>BioDesign, Inc.</td>
			<td>D306</td>
			<td>Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Thrombin</td>
			<td>BioPharm Laboratories, Inc.</td>
			<td>SKU91-055</td>
			<td>Use in step 3.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5156-01</td>
			<td>Use in step 3.11.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-5-MTS</td>
			<td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td>
			<td>G441000</td>
			<td>Use in step 4.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators</td>
			<td>Sartorius, Inc.</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Unstained Broad Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26630</td>
			<td>Use in step 3.7, 3.10 and 3.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>17-5053-01</td>
			<td>Use in step 3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td>
			<td>GE Healthcare, Inc.</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Use in step 3.14.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Use in step 5.2 and 5.5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins

Stromal etkileşim molekülü-1 (STIM1) bir türüdür-ben transmembran protein bulunan endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membran (AM). ER-resident STIM1 am Orai1 kanalları bağışıklık yanıtı sürücüler asıl Ca2 + sinyal gönderme işlemi olan işletilen kalsiyum (Ca2 +) girişi saklamak olarak bilinen bir süreç içinde etkinlik düzenlemektedir. STIM1 Ca2 + algılama etki molekülün içinde iki luminal Asn sitelerdeki post-translational N- glikozilasyon uğrar. Ancak, biyokimya, biyofizik, ve N- glikozile STIM1 yapısı biyolojik etkileri kötü kolaylıkla homojen N- glikozile protein yüksek seviyede elde etmek için son zamanlarda bir yetersizlik nedeniyle kadar anladım. Burada, hangi temel N- glikozilasyon protein yapısı ve etkileri mekanizmasını anlamak için ilgili belirli protein sitelere glikoz moieties verdiği bir vitro kimyasal yaklaşım uygulanması açıklanmaktadır. Çözüm Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak değişiklik her iki verimliliğini yanı sıra tek bir örnek glikoz ekli yapısal sonuçlarını değerlendirmek. Bu yaklaşım kolayca doğada bulunan sayısız glikozile proteinler çalışmaya adapte edilebilir.

Bu yaklaşımın ilk adım mutagenesis glikoz-5-MTS EFSAM kullanılarak değiştirilebilir olabilir Cys artıkları için aday glikozilasyon kalıntılarının yok endojen Cys artıkları, hiçbir özel hususlar öncesinde yapılması gereken bu yüzden gerektirir mutagenesis. Ancak, yerel Cys artıkları açıklanan kimya gerçekleştirmeden önce değiştirilebilir sigara artıkları mutasyona gerekir. En az yerli yapı etkisi için protein ilgi bir küresel dizi hizalaması yapmak öne...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Bölgeye Özgü İnflamatuar mRNA ve Proteini Tespit Etmek İçin Sıçan Epidermis ve Dermis'in Termolysin ile Ayrılması

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...