Name: corneal tissue engineering: an in vitro model of the stromal-nerve interactions of the human cornea
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00
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心から感謝博士ベン ファウラー TEM 実験で彼の技術的な助けを拡張したいと思います。

このプロトコル オクラホマ州健康科学センター大学/機関審査委員会 (IRB #4509) のガイドラインに従います。プロトコルのすべての部分は、ヘルシンキ宣言の原則を会った。国立開発研究所 (NDRI) とオクラホマ州のライオンズ ・ アイバンクから角膜のサンプルを得た。
1. 初代培養細胞の分離
<ol><li>人間の角膜組織サンプルの受領、21.5 cm2シャーレ ダルベッコ滅菌...

<ol>
	<li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+visual+impairment:+2010.">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li><li>R&#246;nkk&#246;, S., Vellonen, K. -. S., J&#228;rvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+cell+culture+models+for+drug+toxicity+studies.">Human corneal cell culture models for drug toxicity studies.</a> Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).</li><li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. 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V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+corneal+wound+healing.">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li><li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+wound+healing.">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li><li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model.">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li><li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+for+assessing+fibroblast+migration+in+3-D+collagen+matrices.">An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).</li><li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease.">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li></ol>

いくつかの研究ができる角膜疾患のよりよい理解の開発を助けると同様の治療法を発見する様々 な動物モデルの開発で注目されています。しかし、これらの研究から人間に重要な価値は確認されていません。日には、様々 な生体外モデルを開発し、広くその顕著な臨床的意義のため調査が。私たち以前に確立された 3 Dの in vitroモデルです新規のシステムで大幅ビジョン研究の?...

人間の体内では、角膜は、難解な神経組織です。神経は接触、苦痛、温度のような様々 な感覚を担当し、また創傷治癒、反射を点滅、涙の生産と分泌5,6,7で重要な役割を持っています。角膜間質の神経幹は輪部の神経叢から発生し、放射状周辺の角膜実質を入力します。間質の神経組織はコラーゲン ラメラに平行、彼らはさらに小さい線維束彼らは実質5,8に向かって進むように分岐します。神経線維はさらに上皮層に浸透し、したがって、神経支配は広く広がって角膜上皮と実質の間で。したがって、神経支配は、角膜の健康と病気の状態の重要な役割を持ちます。このプロトコルでは、体内の神経間質の相互作用を模倣する、その種の最初である新しい 3 Dの in vitroモデルの進歩を明らかにします。SH SY5Y 細胞株は、神経の成長を観察するために使用も特徴と、最も確立されたラインの 1 つであるこの研究に使われました。SH SY5Y 細胞ラインは両方の基板の付着 (S 型) を生成する記載されているし、neuroblastic (N 型) 細胞を分化転換9を受けることができます。結果として、この細胞ラインは N 型セルのトリプルの連続 subclone 選択から派生するにもかかわらずそれも含まれていますレチノイン酸と脳由来を使用してニューロンへの分化過程を受けることができる S 型セルの数が少ない神経栄養因子の9。これは角膜合併症糖尿病網膜症 (DM) やその他の眼の疾患に関連付けられているのより良い理解につながる可能性がありますツールを提供します。ために取得し、眼疾患の患者から神経細胞の培養に伴う困難、この 3 Dの in vitroモデルはニューロン間相互作用の勉強と角膜実質とシグナル伝達における実質的な意味を提供します。
病的状況しばしば妥協の生活の質につながる、非常に大規模で体のさまざまな組織に影響を与えます。眼ジストロフィーは、全身疾患と視力の損失や永久的な視力低下につながる多くの場合関連付けられている一般的な合併症です。包括的な研究は、基底の細胞レベルでの効果と同様に、病気の状態の理解を深めるために不可欠。このような病気の影響を研究するには、様々 な生体内と体外のモデルはティッシュ エンジニア リング アプリケーションの助けを借りて開発されています。Corneal ティッシュ エンジニア リング アプリケーションは、科学10、11,12,13,14では、様々 な分野で大きな関心を集めているが、時に重大な制限があります。実際のアプリケーションは、拒絶反応、感染症、瘢痕10,11,12,13,14を移植角膜を含みます。正常に開発され、様々 な生体外モデル3,15,16,17,18,を設置するいくつかの研究がある19,,2021,22,23,24,25,26。3 Dの in vitroモデルは、最も有望な偉大な科学的な興味の。3 D モデルより体内の細胞および生理学的イベント線維化に重要であり、創傷治癒15,27,28,29をミラーする知られています。これらの in vitroモデルは、角膜合併症を含む異なる病状を治療するための新しい治療上のアプローチを見つけることに不可欠な役割を果たします。角膜の機能に神経支配の重要な役割にもかかわらず角膜組織設計構造2,3で末梢神経の増殖を促進するために少しの努力をしました。ただし、目的の組織機能を達成するために標的組織を模倣する提案 3 D培養細胞構造。
糖尿病角膜症神経欠陥のためここで説明するモデルのための明白なアプリケーションですが、円錐角膜、Fuchs のジストロフィーを含む人間の in vitroモデルの恩恵を受けることができますいくつかの他の角膜疾患があります。当社の 3 D モデルは、この見通しから出現し、ドラッグデリバリー システムを評価するために角膜組織の体外表現と新しい眼薬の安全性の開発を提案します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Healthy corneal tissue</td>
			<td>NDRI</td>
			<td></td>
			<td>Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>13-812-42</td>
			<td>Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>270100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical scalpel blades No.10</td>
			<td>Feather Surgical Blade</td>
			<td>2976#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#8217;s Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>10% FBS is required for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA(1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane inserts with 0.4-&#956;m pores</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-O-&#945;-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SMB00390-14</td>
			<td>A concentration of 0.5 mM should be used for the study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-949-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SHSY5YATCC CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3014-10UG</td>
			<td>Final concentration of 10uM needs to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td>Final concentration of 2nM needs to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>VWR-Alfa Aesar</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-349</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal tissue engineering: an in vitro model of the stromal-nerve interactions of the human cornea

ティッシュ ・ エンジニア リングは、世界角膜視力損失1に苦しんで推定 1000 万人ひと角膜交換のための需要が高いため実質的な認識を得ています。実行可能な人間の角膜、三次元 (3 D) 組織で重要な進歩のための要求に対処するため工学2,3、4を行われています。これら角膜モデル範囲簡単な単分子膜システムから多層モデルでは、3 D の完全厚さ角膜同等2に 。
ただし、3 D ティッシュ エンジニア リングの角膜疾患モデルの in vitroのコンテキストでの使用を検討多層 3 D 角膜組織構造、機能、および異なる種類の細胞 (すなわち、神経ネットワークに欠けている類似している日付上皮、実質、内皮細胞) の2,3。さらに、医薬品のための動物テストを削減する試みで角膜の in vitro組織モデルの需要が増加しています。したがってより洗練されたモデルは人間の生理的要求するシステムに合わせて必要なより患者の人口に関連するモデルの開発が絶対に必要です。主な角膜線維芽細胞 (HCFs) 健康なドナーからから神経細胞の三次元共培養モデルを搭載、角膜内の複数セル型ジストロフィー、フックス、糖尿病角膜症、円錐角膜などの病気やを受けますことを考えるSH SY5Y セルの行。これにより、初めて人間の角膜組織内の 2 つのセル型間の相互作用を調査します。このモデルが神経損傷を示す角膜疾患の神経間質相互作用に関連付けられている基になるメカニズムを解剖して可能性があると考えています。この 3 D モデルは生体内で角膜組織の基本的な解剖学的および生理学的な性質を反映し、角膜欠損を調査だけでなく、様々 なエージェントの有効性を動物実験の前にスクリーニング ツールとして将来的に使用できます。

図 1は、モデル 3 D培養作業の順を追って代表イメージです。最初のステップでは、細胞は人間の角膜から分離されます。その後、ポリカーボネート膜上に成長した、自己分泌の 3 D マトリックスを組み立てるためビタミン C と刺激します。この 3 D 構築システム、多層細胞の生体内での合成を誘導する-間質マトリックスのような。?...

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Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

このプロトコルでは、新規三次元の in vitroモデル、角膜間質細胞と分化した神経細胞が一緒に培養試験と 2 つの細胞のタイプの相互作用の理解を支援するについて説明します。

角膜組織工学: In Vitroのモデル人間の角膜の神経間質相互作用

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

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セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...