Name: corneal tissue engineering: an in vitro model of the stromal-nerve interactions of the human cornea
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00
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우리는 우리의 진심으 감사 닥터 벤 파울러에 대 한 그의 기술 편 실험을 확장 하 고 싶습니다.

이 프로토콜은 오클라호마 보건 과학 센터의 대학/기관 검토 위원회 (IRB #4509)의 지침을 따릅니다. 프로토콜의 모든 부분 헬싱키의 선언의 신조를 만났다. 각 막 샘플 국가 개발 및 연구 연구소 (NDRI)와 오클라호마 라이온 스 안구 은행에서 얻은 했다.
1입니다. 1 차 셀의 격리
<ol><li>21.5 cm2 무 균 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)의 2 개 mL를 포함 하는 배양 접시에 조직 ...

<ol>
	<li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+visual+impairment:+2010.">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li><li>R&#246;nkk&#246;, S., Vellonen, K. -. S., J&#228;rvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+cell+culture+models+for+drug+toxicity+studies.">Human corneal cell culture models for drug toxicity studies.</a> Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).</li><li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. 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M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. 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V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+corneal+wound+healing.">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li><li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+wound+healing.">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li><li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model.">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li><li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. 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여러 연구 결과 각 막 질환의 더 나은 이해를 개발 하는 데 도움이 뿐만 아니라 수 치료를 발견 하는 다양 한 동물 모델 개발에 집중 되었습니다. 그러나, 이러한 연구에서 인 간에 게 중요 한 가치는 확인 되지는 않았습니다. 날짜 하려면, 다양 한 생체 외에서 모델 개발 고 널리 그들의 놀라운 임상 중요성으로 조사 되었습니다. 우리의 이전 설립 3 차원 생체 외에서 모델은 새로운 시?...

인체 각 막에서는 가장 밀도가 innervated 조직입니다. 신경 터치, 고통, 온도, 다양 한 감각에 대 한 책임은 그리고 또한 상처 치유, 반사, 눈물 분 비5,,67및 생산에 필수적인 역할을 했습니다. 각 막, 실질 신경 줄기 limbal 총에서 발생 하 고 광선으로 주변 각 막 stroma를 입력 합니다. Stromal 신경 조직 콜라겐 lamellae 평행 이며, 그들은 더 작은 성숙기로 그들은 천박한 기질5,8쪽으로 진행으로 분기. 상피 층을 관통 하는 신경 섬유를 추가 하 고 따라서, 신경 분포 널리 퍼져 각 막 상피와 기질. 따라서, 신경 분포는 각 막의 건강 하 고 병에 걸린 상태에서 필수적인 역할을 하고있다. 이 프로토콜에서 우리는 vivo에서 stromal 신경 상호 작용을 모방 하는 종류의 첫 번째 모델 소설 3 차원 생체 외에서 의 발전을 공개. 그것은 가장 설립, 잘 특징이 라인 신경 성장을 공부 하는 데 사용 중 SH-SY5Y 셀 라인이이 연구를 위해 사용 했다. SH SY5Y 셀 라인 두 기판 부착 (S 형) 생산 설명 되었으며 neuroblastic (N 형) 세포 transdifferentiation9를 받을 수 있습니다. 그 결과,이 셀 라인은 N 형 셀의 트리플 연속 subclone 선택에서 파생 된, 비록 그것은 또한 포함 retinoic 산 및 두뇌 파생 된 사용을 통해 신경 세포로 분화를 겪고 수 S 형 세포의 작은 수 科 요소9. 이 당뇨병 성 망막 증 (DM) 및 다른 눈 질병와 관련 된 각 막 합병증의 더 나은 이해로 이어질 수 있는 도구를 제공 합니다. 하 고 눈 질병을 가진 환자에서 신경 세포 배양과 관련 된 어려움 때문에이 3D 생체 외에서 모델 신경 상호 작용을 공부 하 고 각 막 stroma로 신호에 상당한 영향을 제공 합니다.
질병 상태는 종종 매우 큰 규모, 손상 된 삶의 질으로 이어지는 신체의 다양 한 조직 영향을. 눈 dystrophies는 종종 조직의 질병 및 시력의 손실 또는 심지어 영구적인 시력 상실을 리드와 관련 된 일반적인 합병증. 포괄적인 연구는 종종 질병 상태 뿐만 아니라 기저 세포 수준에서 효과의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 이러한 질병의 효과 연구, 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델 조직 엔지니어링 응용 프로그램의 도움으로 개발 되었습니다. 각 막 조직 공학 응용 과학10,11,12,,1314, 다양 한 분야에 걸쳐 큰 관심을 얻고 있다 하지만 여전히 주요 제한 중 실제 응용 프로그램을 거부, 감염과 흉터10,11,12,,1314이식 각 막 등. 여러 연구를 성공적으로 개발 하 고 다양 한 생체 외에서 모델3,15,,1617,18, 설립 있다 19,20,21,22,23,,2425,26. 3 차원 생체 외에서 모델은 가장 유망한와 큰 과학적 관심의. 3D 모델은 더 나은 vivo에서 세포 및 생리 적 이벤트 섬유 증 중 중요 하 고 상처 치유15,27,,2829거울 알려져 있습니다. 이러한 생체 외에서 모델 각 막 합병증 등 다른 질병 상태를 치료에 새로운 치료 접근을 찾는 중요 한 역할을. 각 막 기능에 신경 분포의 중요 한 역할에도 불구 하 고 약간의 노력이 했다 각 막 조직 설계 구조2,3내 주변 신경 확산을 촉진. 그러나, 제안 된 3D 생체 외에서 셀 구조는 원하는 조직 기능을 달성 하기 위하여 대상 조직 모방.
당뇨병 각 신경 결함 때문에 여기서 설명 하는 모델에 대 한 명백한 응용 프로그램은, 인간의 생체 외에서 모델 Keratoconus와 Fuchs dystrophies 등 누릴 수 있는 다른 여러 각 막 질환 있다. 우리의 3D 모델이이 전망에서 나온다 고 약 납품을 평가 하기 위해 각 막 직물의 생체 외에서 표현 및 새로운 눈 약의 안전의 개발을 제안.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Healthy corneal tissue</td>
			<td>NDRI</td>
			<td></td>
			<td>Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>13-812-42</td>
			<td>Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>270100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical scalpel blades No.10</td>
			<td>Feather Surgical Blade</td>
			<td>2976#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#8217;s Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>10% FBS is required for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA(1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane inserts with 0.4-&#956;m pores</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-O-&#945;-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SMB00390-14</td>
			<td>A concentration of 0.5 mM should be used for the study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-949-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SHSY5YATCC CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3014-10UG</td>
			<td>Final concentration of 10uM needs to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td>Final concentration of 2nM needs to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>VWR-Alfa Aesar</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-349</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal tissue engineering: an in vitro model of the stromal-nerve interactions of the human cornea

조직 공학 인간 각 막 교체 각 막 시력 손실1에서 고통을 전세계 약 10 백만 명에 대 한 높은 수요로 인해 상당한 인정을 받고 있다. 가능한 인간 각, 3 차원 (3D) 조직에 중요 한 진행에 대 한 수요를 해결 하기 위해 공학이 했다2,,34. 이러한 각 막 모델 에서부터 간단한 단층 시스템 3D 전체 두께 각 막 등가물2로 이어지는 다층된 모델.
그러나, 생체 외에서 질병 모델의 맥락에서 3 차원 조직 설계 각 막의 사용 날짜 부족 유사 다층된 3 차원 각 막 조직 구조, 기능, 및 서로 다른 세포 유형 (즉, 신경, 네트워킹을 공부 상피와 기질, 내 피)2,3. 또한, 생체 외에서 각 막 조직 모델에 대 한 수요는 제약 제품에 대 한 동물 실험을 줄이기 위해 시도에서 증가 했다. 따라서, 더 정교한 모델은 인간의 생리 적 요구 사항, 시스템 일치 하는 데 필요한 그리고 더 환자 인구에 관련 된 모델의 개발은 절대적으로 필요 하다. 각 막에 여러 세포 유형 영향을 받는 질환과 dystrophies Keratoconus, 당뇨병 각 Fuchs, 등을이 모델에 포함 된 기본 인간 각 막 섬유 아 세포 (HCFs) 건강 한 기증자와에서 뉴런에서의 3D 공동 문화 모델 SH SY5Y 셀 라인입니다. 인간의 각 막 조직 내에서 2 개의 세포 유형 사이 상호 작용을 조사 하기 위해 처음으로 수 있습니다. 우리는이 모델 잠재적으로 관련 된 신경 손상 하는 각 막 질환의 신경 기질 상호 작용 하는 근본적인 메커니즘을 해 부 수 믿습니다. 이 3D 모델 vivo에서 각 막 직물의 기본 해 부 및 생리 적 특성을 반영 하 고 수 도구로 사용 될 미래에는 각 막 결함 조사로 동물 테스트 하기 전에 다양 한 에이전트의 효능을 심사.

그림 1 은 작업 모델 3D 생체 외에서 단계별 대표 이미지입니다. 첫 번째 단계에서 세포 인간 각 막에서 격리 됩니다. 다음, 그들은 폴 리카 보 네이트 막에 성장 하 고 자기 secreted 3 차원 매트릭스를 비타민 C와 자극. 이 3D 구조 시스템 유도는 다층 세포 vivo에서의 합성-stromal 매트릭스 처럼. 그 후, 신경 세포는 신경 세포 분화를 시작 하 여...

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Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

이 프로토콜에는 새로운 3 차원 생체 외에서 모델을, 어디 각 막 실질 세포와 분화 된 신경 세포 교양 함께 시험에는 두 종류의 세포 상호 작용의 이해를 돕기 위해 설명 합니다.

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

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개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em&gt; 체외에서</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...