Name: corneal tissue engineering: an in vitro model of the stromal-nerve interactions of the human cornea
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00
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Gostaríamos de estender nossos sinceros agradecimentos ao Dr. Ben Fowler para sua ajuda técnica com os experimentos de temperatura.

Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de revisão de Universidade de Oklahoma Health Sciences Center/institucional (IRB #4509). Todas as partes do protocolo de conheceram os princípios da declaração de Helsinki. Corneais amostras foram obtidas de desenvolvimento nacional e Instituto de pesquisa (NDRI) e o banco de olhos do Lions de Oklahoma.
1. isolamento de células primárias
<ol><li>Após a recepção de amostras de tecido da córnea humana, transferir os tecidos em um 21,5 cm...

<ol>
	<li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+visual+impairment:+2010.">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li><li>R&#246;nkk&#246;, S., Vellonen, K. -. S., J&#228;rvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+cell+culture+models+for+drug+toxicity+studies.">Human corneal cell culture models for drug toxicity studies.</a> Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).</li><li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. 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M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+modeling+of+the+central+nervous+system.">3D in vitro modeling of the central nervous system.</a> Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).</li><li>Schulz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Corneal+Cell-Based+Microenvironment+as+Prerequisite+for+Balanced+3D+Corneal+Epithelial+Morphogenesis:+A+Promising+Animal+Experiment-Abandoning+Tool+in+Ophthalmology.">Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).</li><li>Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204-5p-Mediated+Regulation+of+SIRT1+Contributes+to+the+Delay+of+Epithelial+Cell+Cycle+Traversal+in+Diabetic+Corneas.">MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).</li><li>Koulikovska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+regeneration+of+corneal+tissue+via+a+bioengineered+collagen+construct+implanted+by+a+nondisruptive+surgical+technique.">Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).</li><li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+corneal+wound+healing.">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li><li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+wound+healing.">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li><li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model.">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li><li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+for+assessing+fibroblast+migration+in+3-D+collagen+matrices.">An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).</li><li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease.">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li></ol>

Vários estudos têm sido focados no desenvolvimento de vários modelos de animais que podem ajudar a desenvolver uma melhor compreensão de doenças da córnea, bem como descobrir tratamentos. No entanto, um valor significativo para os seres humanos destes estudos não foi verificado. Até à data, vários em vitro modelos foram desenvolvidos e amplamente investigadas devido a sua notável importância clínica. Nosso modelo estabelecido anteriormente 3D em vitro é um sistema inovador que significativ...

No corpo humano, a córnea é o tecido mais densamente inervado. Os nervos são responsáveis por várias sensações como o toque, dor, temperatura e também têm um papel essencial na cicatrização de feridas, piscar reflexos, rasgar a produção e secreção de5,6,7. Na córnea, estromais troncos nervosos surgem do plexo limbal e insira o estroma da córnea periférico radialmente. A organização do nervo do estroma é paralela as lamelas de colágeno e eles ainda mais ramificam em fascículos menores como proceder para o estroma superficial5,8. As fibras nervosas mais penetrar a camada epitelial e assim, inervação é amplamente espalhada por todo o epitélio corneano e o estroma. Portanto, a inervação tem um papel essencial no estado saudável e doente da córnea. Neste protocolo, revelamos o avanço de um modelo novela 3D em vitro , que é a primeira de seu tipo para imitar as interações do estroma-nervo na vivo . A linha de celular de SH-SY5Y foi utilizada para este estudo, como é uma das linhas mais estabelecidas, bem caracterizadas usadas para estudar o crescimento neuronal. A linha de celular de SH-SY5Y tem sido descrita para produzir ambos os aderentes do substrato (tipo S) e neuroblastic (N-tipo) de células que podem sofrer transdiferenciação celular9. Como resultado, mesmo que esta linha de celular é derivada de uma seleção de triplo subclone sucessivas de células de tipo N, ele também contém um pequeno número de células do tipo S capazes de sofrer diferenciação em neurônios através do uso de retinoico ácido e derivado do cérebro Neurotrophic factor9. Isso fornece uma ferramenta que pode levar a uma melhor compreensão das complicações da córnea associado com retinopatia diabética (DM) e outras doenças oculares. Devido as dificuldades associadas com a obtenção e cultivo de neurônios de pacientes com doença ocular, este modelo 3D em vitro fornece implicações substanciais em estudar as interações neuronais e sinalizando com o estroma corneano.
Condições de doentes frequentemente afetam vários tecidos do corpo a uma escala muito grande, levando a uma qualidade de vida comprometida. Distrofias oculares são complicações comuns, frequentemente associadas com doenças sistêmicas e levam à perda de acuidade visual ou perda de visão até mesmo permanente. Estudos exaustivos muitas vezes são essenciais para uma melhor compreensão da condição da doença, bem como os efeitos a nível celular basal. Para estudar os efeitos de tais doenças, foram desenvolvidos vários modelos in vivo e in vitro com a ajuda de aplicações de engenharia de tecidos. Aplicações da engenharia do tecido corneal tem atraído grande interesse através dos vários campos da ciência10,11,12,13,14, mas existem ainda grandes limitações durante aplicação real, incluindo corneal enxerto rejeições, infecções e cicatrizes10,11,12,13,14. Existem vários estudos que desenvolveram com sucesso e estabeleceu várias em vitro modelos3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Os modelos 3D em vitro são os mais promissores e de grande interesse científico. Modelos 3D são conhecidos para melhor espelhar na vivo celular e fisiológico eventos que são essenciais durante a fibrose e o ferimento de28,de27,de15,cura29. Estes modelos em vitro desempenham um papel integral na busca de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de condições diferentes da doença, incluindo complicações da córnea. Apesar do papel crítico da inervação em funções da córnea, fez pouco esforço para promover a proliferação de nervo periférico dentro de construções de engenharia de tecido corneal2,3. No entanto, as construções propostas 3D em vitro celular imitam o tecido-alvo para atingir a funcionalidade do tecido desejado.
Enquanto keratopathy diabética é uma aplicação óbvia para o modelo aqui descrito por defeito neuronal, existem várias outras doenças da córnea que podem se beneficiar de um modelo humano em vitro incluindo distrofias ceratocone e Fuchs. Nosso modelo 3D emerge esta perspectiva e propõe o desenvolvimento de uma representação em vitro do tecido da córnea para avaliar a administração de medicamentos e segurança de novos medicamentos oculares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Healthy corneal tissue</td>
			<td>NDRI</td>
			<td></td>
			<td>Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>13-812-42</td>
			<td>Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>270100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical scalpel blades No.10</td>
			<td>Feather Surgical Blade</td>
			<td>2976#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#8217;s Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>10% FBS is required for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA(1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane inserts with 0.4-&#956;m pores</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-O-&#945;-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SMB00390-14</td>
			<td>A concentration of 0.5 mM should be used for the study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-949-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SHSY5YATCC CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3014-10UG</td>
			<td>Final concentration of 10uM needs to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td>Final concentration of 2nM needs to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>VWR-Alfa Aesar</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-349</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal tissue engineering: an in vitro model of the stromal-nerve interactions of the human cornea

Engenharia de tecidos ganhou reconhecimento substancial devido à alta demanda para as substituições de córnea humana com cerca 10 milhões de pessoas no mundo sofrem de perda de visão da córnea1. Para atender a demanda de córneas humanas viáveis, progressos significativos em tecido tridimensional (3D) engenharia foi feita2,3,4. Estes córnea modelos variam de sistemas monocamada simples até modelos de várias camados, levando a 3D cheio-espessura corneal equivalentes2.
No entanto, o uso de uma córnea 3D engenharia de tecidos, no contexto dos modelos de doença em vitro estudou a semelhança de falta de data para a estrutura de várias camadas de tecido corneal 3D, função e a interconexão dos diferentes tipos de células (ou seja, nervo, epitélio, estroma e endotélio)2,3. Além disso, a procura de modelos de tecido em vitro córnea tem aumentado na tentativa de reduzir a testes em animais para produtos farmacêuticos. Assim, modelos mais sofisticados são necessários para melhor coincidir com sistemas às exigências fisiológicas humanas e o desenvolvimento de um modelo que é mais relevante para a população de pacientes seja absolutamente necessário. Dado que vários tipos de células na córnea são afetados por doenças e distrofias, tais como ceratocone, ceratopatia diabética e Fuchs, este modelo inclui um modelo 3D co-cultura de fibroblastos da córnea humanos primários (HCFs) de doadores saudáveis e os neurônios de a linha de celular de SH-SY5Y. Isto permite-pela primeira vez investigar as interações entre os tipos de dois célula dentro do tecido da córnea humano. Acreditamos que este modelo poderia potencialmente dissecar os mecanismos subjacentes associados com as interações de nervo do estroma corneal doenças que apresentam danos do nervo. Este modelo 3D espelha a natureza básica de anatômica e fisiológica do tecido corneal na vivo e pode ser usado no futuro como uma ferramenta para investigar defeitos da córnea, bem como a eficácia dos vários agentes de triagem antes de testes em animais.

A Figura 1 é uma passo a passo imagem representativa do modelo de trabalho 3D em vitro . Na primeira etapa, as células são isoladas da córnea humana. Em seguida, são cultivadas em uma membrana de policarbonato e estimuladas com vitamina C para montar uma matriz 3D auto secretado. Este sistema de construção 3D induz a síntese de um várias camadas celulares na vivo-como matriz do estroma. Posteriormente, as células de neuroblastoma s...

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Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Este protocolo descreve um romance tridimensional em vitro modelo, onde as células do estroma corneana e diferenciada de células neuronais são cultivadas juntos para ajudar na análise e compreensão das interações dos tipos de célula de dois.

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Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...