Name: corneal tissue engineering: an in vitro model of the stromal-nerve interactions of the human cornea
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00
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Nos gustaría extender nuestro sincero agradecimiento a Dr. Ben Fowler por su ayuda técnica con los experimentos TEM.

Este protocolo sigue las directrices de la Junta de revisión de la Universidad de Oklahoma Health Sciences Center/institucional (IRB #4509). Todas las partes del Protocolo se reunió con los principios de la declaración de Helsinki. Se obtuvieron muestras corneales de desarrollo nacional e Instituto de investigación (NDRI) y Oklahoma Lions Eye Bank.
1. aislamiento de células primarias
<ol><li>Tras la recepción de las muestras de tejido de la córnea humana, transferencia de los tejidos ...

<ol>
	<li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+visual+impairment:+2010.">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li><li>R&#246;nkk&#246;, S., Vellonen, K. -. S., J&#228;rvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+cell+culture+models+for+drug+toxicity+studies.">Human corneal cell culture models for drug toxicity studies.</a> Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).</li><li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+fibrosis:+an+in+vitro+model.">Human corneal fibrosis: an in vitro model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).</li><li>Chen, F. M., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+biomaterials+of+human+origin+for+tissue+engineering.">Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering.</a> Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).</li><li>Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+3D+In+Vitro+Model+to+Accelerate+the+Development+of+Human+Therapies+against+Corneal+Diabetes.">Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes.</a> PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).</li><li>Karamichos, D., Hjortdal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratoconus:+tissue+engineering+and+biomaterials.">Keratoconus: tissue engineering and biomaterials.</a> J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).</li><li>Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. 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M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+modeling+of+the+central+nervous+system.">3D in vitro modeling of the central nervous system.</a> Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).</li><li>Schulz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Corneal+Cell-Based+Microenvironment+as+Prerequisite+for+Balanced+3D+Corneal+Epithelial+Morphogenesis:+A+Promising+Animal+Experiment-Abandoning+Tool+in+Ophthalmology.">Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).</li><li>Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204-5p-Mediated+Regulation+of+SIRT1+Contributes+to+the+Delay+of+Epithelial+Cell+Cycle+Traversal+in+Diabetic+Corneas.">MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).</li><li>Koulikovska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+regeneration+of+corneal+tissue+via+a+bioengineered+collagen+construct+implanted+by+a+nondisruptive+surgical+technique.">Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).</li><li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+corneal+wound+healing.">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li><li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+wound+healing.">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li><li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model.">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li><li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+for+assessing+fibroblast+migration+in+3-D+collagen+matrices.">An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).</li><li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease.">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li></ol>

Varios estudios se han centrado en el desarrollo de diversos modelos animales que pueden ayudar a desarrollar una mejor comprensión de enfermedades corneales, así como descubrir tratamientos. Sin embargo, un valor significativo a los seres humanos de estos estudios no ha sido verificado. Hasta la fecha, varios modelos en vitro se han desarrollado e investigado ampliamente debido a su notable significación clínica. Nuestro modelo previamente establecido 3D en vitro es un novedoso sistema que signific...

En el cuerpo humano, la córnea es el tejido más densamente inervado. Los nervios son responsables de varias sensaciones como el tacto, dolor, temperatura y también tienen un papel esencial en la cicatrización de heridas, reflejos de parpadeo, rasgar la producción y secreción5,6,7. En la córnea, stromal troncos del nervio surgen del plexo limbal y escriba del estroma corneal periférico radialmente. La organización de stromal del nervio es paralela a las laminillas de colágeno y más ramifican en pequeños fascículos como proceden hacia el estroma superficial5,8. Las fibras nerviosas más penetran en la capa epitelial y por lo tanto, la inervación es ampliamente repartida por el epitelio corneal y el estroma. Por lo tanto, la inervación tiene un papel esencial en el estado sano y enfermo de la córnea. En este protocolo, nos revelan el avance de un modelo de novela 3D en vitro , que es la primera de su tipo a imitar las interacciones en vivo stromal del nervio. La línea de células SH-SY5Y fue utilizada para este estudio, ya que es una de las líneas establecidas, bien caracterizadas, utilizadas para estudiar el crecimiento neuronal. Se ha descrito para producir ambos adherentes de substrato (S-type) la línea de células SH-SY5Y y neuroblastic (tipo N) de las células que pueden experimentar transdifferentiation9. Como resultado, a pesar de que esta línea celular se deriva de una selección triple subclone sucesivas de células de tipo N, también contiene un pequeño número de células de tipo S capaces de someterse a la diferenciación a neuronas mediante el uso de retinoico ácido y derivado del cerebro Neurotrophic factor9. Esto proporciona una herramienta que puede llevar a una mejor comprensión de las complicaciones corneales asociados con la retinopatía diabética (DM) y otras enfermedades oculares. Debido a las dificultades asociadas con la obtención y cultivo de neuronas de pacientes con enfermedad ocular, este modelo 3D en vitro proporciona importantes implicaciones en el estudio de las interacciones neuronales y señalización con el tejido conectador córneo.
Condiciones enfermas a menudo afectan a varios tejidos del cuerpo a muy gran escala, conducen a una calidad de vida comprometida. Dystrophies oculares son complicaciones comunes a menudo asociadas con enfermedades sistémicas y conducen a la pérdida de la agudeza visual o incluso permanente de la visión. Estudios completos son a menudo esenciales para una mejor comprensión de la condición de la enfermedad, así como los efectos a nivel celular basal. Para estudiar los efectos de estas enfermedades, se han desarrollado varios modelos en vivo y en vitro con la ayuda de aplicaciones de ingeniería de tejidos. Aplicaciones de ingeniería de tejido corneal han cosechado gran interés en diversos campos de la ciencia10,11,12,13,14, pero hay aún grandes limitaciones en aplicación efectiva, incluyendo corneal del injerto rechazos, infecciones y cicatrices10,11,12,13,14. Hay varios estudios que han desarrollado con éxito y estableció varios en vitro modelos3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Los modelos 3D en vitro son los más prometedores y de gran interés científico. Modelos 3D son conocidos para reflejar mejor los en vivo celulares y fisiológicas eventos que son esenciales durante la fibrosis y la herida curativo15,27,28,29. Estos modelos en vitro desempeñan un papel integral en la búsqueda de nuevos enfoques terapéuticos para tratar las diferentes enfermedades incluyendo las complicaciones corneales. A pesar del papel fundamental de la inervación corneal funciones, poco esfuerzo se ha promover proliferación periférica del nervio dentro de construcciones de ingeniería de tejido corneal2,3. Sin embargo, las propuesta 3D en vitro célula construcciones imitan el tejido diana para lograr la funcionalidad deseada del tejido.
Mientras keratopathy diabética es una aplicación obvia para el modelo descrito aquí debido a los defectos neuronales, hay varias otras enfermedades corneales que pueden beneficiarse de un modelo humano en vitro incluyendo distrofias queratocono y Fuchs. Nuestro modelo 3D surge de esta perspectiva y propone el desarrollo de una representación en vitro de tejido corneal para evaluar el suministro de medicamentos y la seguridad de nuevos medicamentos oculares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Healthy corneal tissue</td>
			<td>NDRI</td>
			<td></td>
			<td>Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>13-812-42</td>
			<td>Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>270100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical scalpel blades No.10</td>
			<td>Feather Surgical Blade</td>
			<td>2976#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#8217;s Minimum Essential Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td>10% FBS is required for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin EDTA(1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane inserts with 0.4-&#956;m pores</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-O-&#945;-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SMB00390-14</td>
			<td>A concentration of 0.5 mM should be used for the study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax block</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-949-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SHSY5YATCC CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3014-10UG</td>
			<td>Final concentration of 10uM needs to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td>Final concentration of 2nM needs to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>VWR-Alfa Aesar</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-349</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

corneal tissue engineering: an in vitro model of the stromal-nerve interactions of the human cornea

Ingeniería de tejidos ha ganado reconocimiento sustancial debido a la alta demanda de reemplazo de la córnea humana con un estimado 10 millones de personas sufren de pérdida de visión córnea1. Para atender la demanda de córneas humanas viables, progresos significativos en el tejido (3D) tridimensional ingeniería se ha hecho2,3,4. Estos córnea modelos oscilan los sistemas monocapa simple a modelos de varias capas, a 3D equivalentes corneal de espesor completo2.
Sin embargo, el uso de una córnea de ingeniería de tejido 3D en el contexto de modelos de enfermedad en vitro estudiados a la fecha no tiene semejanza a la estructura de varias capas 3D tejido corneal, función y la interconexión de diferentes tipos de células(es decir, nervio, epitelio, estroma y endotelio)2,3. Además, ha aumentado la demanda de en vitro modelos de tejido de córnea en un intento de reducir los ensayos con animales para productos farmacéuticos. Por lo tanto, modelos más sofisticados deben adaptarse mejor a los sistemas a las necesidades fisiológicas humanas, y el desarrollo de un modelo que es más relevante para la población de pacientes es absolutamente necesario. Dado que múltiples tipos de células en la córnea son afectados por enfermedades y distrofias, como queratocono, Keratopathy diabética y Fuchs, este modelo incluye un modelo 3D co-cultivo de fibroblastos corneales humanos primarios (HCF) de donantes sanos y neuronas de la línea de células SH-SY5Y. Esto nos permite por primera vez a investigar las interacciones entre los dos tipos celulares en el tejido de la córnea humano. Creemos que este modelo podría potencialmente diseccionar los mecanismos subyacentes asociados con las interacciones estroma-nervio de enfermedades corneales que presentan daños del nervio. Este modelo 3D refleja la naturaleza anatómica y fisiológica básica del tejido corneal en vivo y puede utilizarse en el futuro como una herramienta para investigar defectos corneales, así como la eficacia de diversos agentes de detección antes de los ensayos con animales.

La figura 1 es una imagen representativa paso a paso del modelo de trabajo 3D en vitro . En el primer paso, las células están aisladas de córneas humanas. Entonces, son cultivadas en una membrana de policarbonato y estimulados con vitamina C para ensamblar una matriz 3D auto secretada. Este sistema de construcción 3D induce la síntesis de una de varias capas celulares en vivo-como matriz estromal. Después de eso, se siembran las célul...

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Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Este protocolo describe un novela tridimensional en vitro modelo, donde las células del estroma corneales y las células neuronales diferenciadas se cultivan juntos para ayudar en el examen y la comprensión de las interacciones de los dos tipos celulares.

Ingeniería del tejido fino córneo: Un In Vitro modelo de las interacciones estroma-nervio de la córnea humana

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...