Name: development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines
Uploaded: 2017-09-13T15:00:00
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우리는 빈 강 SCP2 셀 라인을 제공 하기 위한 및 편집에 크리스티 아 베르나를 감사 하 고 싶습니다.

인간 osteoclasts 준 서 면된 동의 연구에 참여 하는 건강 한 기증자의 PBMCs에서 분화 되었다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
 1. osteoclast 차별화 참고: EDTA에 건강 한 인간 기증자 로부터 말 초 혈액 이나 버 피 코트를 수집. 말 초 혈액의 미만 20 mL를 사용 하지 마십시오. 버 피 코트는 들은 단 세포의 더...

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	<li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+and+cancer:+the+osteoncology.">Bone and cancer: the osteoncology.</a> Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).</li><li>Coleman, R. E., Rubens, R. 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E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF,+TNFalpha+and+RANK+ligand+promote+osteoclast+survival+by+signaling+through+mTOR/S6+kinase.">M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase.</a> Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).</li><li>Sugatani, T., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/Akt2+and+mammalian+target+of+rapamycin/Bim+play+critical+roles+in+osteoclast+differentiation+and+survival,+respectively,+whereas+Akt+is+dispensable+for+cell+survival+in+isolated+osteoclast+precursors.">Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors.</a> J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).</li><li>Bertoldo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+metastatic+cancer:+role+of+the+mTOR+pathway.">Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).</li><li>Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cord&#243;n-Cardo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone.">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li><li>Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everolimus+restrains+the+paracrine+pro-osteoclast+activity+of+breast+cancer+cells.">Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).</li></ol>

모델 전 임상 시험관에 암 세포 및 뼈 세포 사이 누화의 메커니즘을 공부 하 고 새로운 치료 전략을 만드는 데 사용할 수 있는 뼈 전이의 메커니즘을 식별 하기 위해 필요 합니다. 우리는 모델을 완벽 하 게 인간의 생체 외에서 인간 주변 혈액 (그림 3)에서 osteoclastogenesis의 개발. 방법론의 최적화 하는 동안 중요 한 포인트의 번호 식별 하 고 해결 했다. 첫 번째 씨...

뼈 질병1,2,3의 과정에서 뼈 전이 개발 하는 환자의 20-25%와 폐, 유 방, 전립선 암, 등 기본 종양의 종류에 대 한 전이의 일반적인 사이트입니다. 특히, 유 방 암 환자의 70% 죽음4에서 뼈 전이의 증거를가지고. 종양 및 stromal 세포 상호 작용은 암 진행에 필수적인 기본 암에 보조 병 변. 뼈 microenvironment에서 유방암에서 osteolytic 뼈 전이 암 세포, 뼈 세포, 뼈 microenvironment 사이 발생 하는 병 적인 악순환의 설립에 따라 달라 집니다. 암 세포 뼈 재흡수5,,67증가 뼈 균형을 방해.
정상 및 병 적인 조건에서 osteoclasts는 뼈 재흡수에 대 한 책임 셀 반면 osteoblasts, 입금 새로운 매트릭스에 새로운 뼈 대형8에 대 한 책임이 있습니다. Osteoclast 활동 RANKL, 사전 osteoclast 표면에 그것의 수용 체 순위를 바인딩하는 사전 osteoclast 퓨전, 차별화 성숙한 osteoclasts에 필요한 과정을 유도의 표현을 통해 osteoblasts에 의해 통제 된다. Osteoclastogenesis의 유도 뼈 재흡수를 증가합니다. Vivo에서 연구의 많은 수는 크게 뼈 전이 형성9,,1011의 우리의 이해를 개선 했다. 유방암 세포 주 종양에서와 뼈 microenvironment에서 osteoclastogenesis 홍보 뼈 항상성 교란 하 고 뼈 재흡수8. 이 시나리오에서는 모든 분자 사이 상호 작용에 발생 하는 암 세포와 osteoclasts에 중요 한 중요성의. 이미 언급 했 듯이, vivo에서 쥐 모델에서 뼈 전이 형성의 메커니즘을 해명 되었습니다 했습니다. 그러나, 모든 vivo에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인에 대 한 필요, 이외에 높은 비용 및 시간이 걸리는 방법을 포함 vivo에서 실험을 수행 하는 것 다른 몇 가지 단점이 있다. 몇몇 저자는 사전 osteoclasts 라는 RAW246.79,,1011의 murine 라인을 사용 하 여 osteoclastogenesis의 전 임상 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델을 결합 했다. 이 모델의 단점이 사실 셀 이미 사전 osteoclasts 되기 위해 최선을 다하고 있습니다 및 인간 근원의 하지 않습니다에서 줄기. 이러한 이유로, 변환 연구는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델의 뼈 암 세포 상호 작용을 공부 하 여부에서 크게 유익할 수 있었다.
우리 osteoclastogenesis에서 생체 외에서 인간 주변 혈액 샘플12,13에서 시작 하는 방법을 최적화 합니다. Osteoclasts는 monocytes는 존재, 이기는 하지만 작은 정도에, 말 초 혈액 샘플에서에서 파생. 단 세포는 먼저 구분 granulocytes 전체 혈액에 존재 하 고 적혈구에서 Ficoll 밀도 기울기; 그들은 다음 세포와 달리 플라스틱 기판에 그들의 능력 덕분에 선택 됩니다. 시드, 후 셀 14 일 동안 교양. MCSF 및 RANKL GFs monocytes에 먼저 대 식 세포로 그리고 osteoclasts14,15차별화 하는 데 필요한 있습니다. RANKL은 osteoclastogenesis의 후반 단계에서 분화 과정을 유도 하는 데 사용 됩니다 반면 MCSF의 분석 결과, 전체 기간 동안 필요 합니다. 차별화의 초기 단계에서 MCSF monocytes 증식 및14,15살아남을 수 있습니다. Osteoclastogenesis의 두 번째 부분에서, 세포 융합 및 osteoclasts, 고리에 걸 F의 특성 분포를 보여 주는 및 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정), 칼 시 토 닌 수용 체 등 특정 마커를 표현으로 성숙 (CTR) 14 , 15. 우리의 방법을 일 7 ~ 14에서에서 실험 및 MCSF와 RANKL의 첫 번째 7 일 동안 monocyte 문화에 MCSF를 추가 구성 됩니다. 실험의 끝에, osteoclastogenesis로 아래 차별화 된 셀을 계산 하 여 분석 된다.
GFs에 의해 분화를 유도 하는 monocyte 문화는 우리의 전 임상 모델의 기초를 형성 한다. 우리 유방암 세포의 osteoclastogenic 힘을 더 잘 이해 하는 GFs 없이 공동 문화 시스템 최적화. 우리가 먼저 개발 간접 공동 문화 매체를 추가 하 여 (80% α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 20% 조절 매체에서에서 수집 된 유방암 세포의 문화는 했다 셀에 약 90% 합칠 겪고 차별화12 . (혈 청 부족 조건 하에서 수집 되지 않습니다) 바른된 매체 24 시간 후 수집 된 고 1: 4의 비율에 신선한 매체와 혼합. 바른된 매체 부정적인 제어에 관하여 상당한 osteoclast 차별화를 유도 한다. 그러나, 암 세포 및 뼈 세포 간의 상호 상호 작용에 대 한 정보는 손실 간접 공동 문화를 사용 하는 경우, 우리는 개선 우리의 시스템 직접 공동 문화를 수행 하 여. 우리는 0.4 µ M 삽입 및 단 세포 도금 했다 우물에 그들을 배치에서 암 세포를 시드. 이 메서드를 사용 하 여 셀 같은 매체를 공유 하 고 분 비 단백질을 교환 한다. 우리는 따라서 osteoclastogenesis 암 세포13에 의해 유도 된의 완전히 인간의 전 임상 모델을 만들었습니다.
이 시스템은 매우 다재 다능 하 고 다른 연구 목적, 예를 들면, 뼈 전이에 약물의 역할을 조사 하는 약리 연구에 사용 될 수 있습니다. 우리의 모델 효능과 뼈-타겟 요법 암 세포13의 뼈 microenvironment에 antitumor 약물의 행동의 메커니즘을 연구를 가능 하 게. 올바른 컨트롤 실험 설계, 즉, 암 세포와 개별적으로 경작 osteoclasts 쉽게 마약 활동에 공동 문화에 미치는 영향을 이해 하는 것 있습니다. 이 이렇게 공부 되 고 마약 대상 모두 암 세포와, 예를 들어, osteoclasts everolimus16때 더욱 흥미로운 됩니다. 이 모델은 또한 암 세포 및 뼈 세포 사이 상호 작용의 새로운 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BE12-169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life-technologies</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life-technologies</td>
			<td>ECS0180DPR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hMCSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>Storage indications must be respected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hRANKL</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>310-01</td>
			<td>Storage indications must be respected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphocyte separation media</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0560-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood cell lysing buffer</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>11814389001 
			ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>EuroClone</td>
			<td>COD. ECB3052D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-HTB-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470-Clear</td>
			<td>These inserts are for 24-well plates; 
			6.5 mm, 0.4 &#956;M; 
			pore size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines

종양 세포 및 뼈 세포 뼈 microenvironment에서 사이 누화 뼈 전이 형성의 메커니즘 이해 결정적 이다. 우리는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델을 유방암 세포 및 osteoclasts로 차별화를 진행 하는 monocytes의 공동 문화를 개발 했다. 우리는 주변 혈액 건강 한 기증자 로부터 수집 된 샘플에서 시작 하는 osteoclastogenesis의 모델을 최적화. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) 처음 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 분리, 높은 밀도에서 시드 되었고 두 성장 인자 (GFs)을 추가 하 여 차별화 하는 유도: 핵 요인-κB ligand (RANKL) 및 대 식 세포의 수용 체 활성 콜로 니 자극 인자 (MCSF). 셀은 14 일 문화에 남아 다음 고정 고 다운스트림 분석 하 여 분석. Osteolytic 뼈 전이에 뼈에 암 세포 도착의 효과 중 하나는 osteoclastogenesis의 유도 이다. 우리는 따라서 GFs와 관련 하 여 암 세포의 분화 능력 연구 유방암 세포의 공동 문화 우리의 모델 도전. 암 세포 osteoclast 상호 작용을 공부 하는 간단한 방법 간접 공동 문화 조절된 매체 유 방 암 세포 배양에서 수집 하 고 신선한 매체와 혼합의 사용에 따라 수행 하는 것입니다. 이 혼합물 다음 osteoclast 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 우리는 또한 직접 공동 문화는 암에서 세포, monocytes 분화를 겪고 매체 공유와 분 비 요소를 교환 하는 방법을 최적화 합니다. 이것은 상당한 개선을 원래 간접 공동 문화 메서드를 통해 연구자는 두 종류의 세포 상호 작용을 관찰 하 고 암 세포와 osteoclasts 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 유방암에서 파생 된 씨 셀 라인을 전이성 뼈 microenvironment에 약물의 효과 연구 수 있습니다. 모델도 골다공증 또는 다른 뼈 조건 등 다른 질병 연구를 사용할 수 있습니다.

메서드는 쉽게 인간의 말 초 혈액에 monocytes osteoclasts를 구별 하기 위해 최적화 되었다. Monocyte 문화 암 세포, 암 세포의 뼈 전이에 osteoclastogenesis를 유지 할 수 있다 (문학18에서 같이) 확인을 경작 했다. Osteoclasts 암 세포에서 분화 하 고 GFs는 그림 1에 나와 있습니다. Osteoclast 같은 셀 있는 셀 4 이상의 핵 이며 트랩 (보라색 세포를) 얼룩...

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Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

연구

암 연구학

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론<em&gt; 드 노보</em&gt; 유방암 전이

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

주변 방사선 조사에 의해 유도 된 피로의 마우스 모델

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

아파티닙 내성 폐 선암 종 PC-9 세포주 의 설립 및 특성은 아파티닙의 증가 복용량으로 개발

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...