Name: mapping genome-wide accessible chromatin in primary human t lymphocytes by atac-seq
Uploaded: 2017-11-13T13:00:00
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Diese Arbeit wird unterstützt von der Israel Science Foundation (Grant 748/14), Marie-Curie-Integration gewähren (CIG) - RP7-Menschen-20013-CIG-618763 und -CORE Programm für Planung und Budgetierung Ausschuss und der Israel Science Foundation grant Nr. 41/11.

alle Verfahren wurden von institutionellen Review Board der Bar-Ilan-Universität angenommen und das Protokoll folgt den Richtlinien des Ausschusses zur Genehmigung der Experimente zur Verfügung gestellt.
 1. Reinigung von naiven CD4 + Zellen und Polarisation zu T-Helfer-1 (Th1) und Th2-Zellen Hinweis: hier beschreiben wir die Vorgehensweise, die gefrorenen menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) ab. Der erste Schritt besteht aus CD4 + Zellen mitt...

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	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).</li><li>Thurman, R. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA.">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li></ol>

Das hier beschriebene ATAC-Seq-Protokoll erfolgreich eingesetzte für die Analyse von zugänglich Chromatin in primäre Zellen (menschliche Th1, Th2 Zellen und B-Zellen) sowie die kultivierten Zelllinien (MCF10A menschlichen Brustkrebszellen und U261-Glioblastom-Zellen). Andere Zelltypen ATAC-Seq zuweisen kann einige Protokoll-Optimierung, vor allem in der Lyse Schritt erfordern. Wenn die Konzentration von nichtionischen Waschmittel zu hoch ist, liegt möglicherweise ein höherer Prozentsatz der mitochondrialen DNA-Konta...

ATAC-Seq1,2 ist eine robuste Methode, die Ermittlung der regulatorischen3 offene Chromatin Regionen und Nukleosom Positionierung ermöglicht. Diese Information gilt für ableiten, die Lage, die Identität und die Aktivität von Transkriptionsfaktoren. Die Methode Empfindlichkeit zur Messung der quantitative Abweichungen in Chromatinstruktur ermöglicht die Untersuchung der Aktivität von Chromatin Faktoren, einschließlich Chromatin Remodelers und Modifikatoren sowie die transkriptionelle Aktivität der RNA-Polymerase II1. ATAC-Seq bietet somit einen leistungsstarke und unvoreingenommenen Ansatz für die Entschlüsselung der Mechanismen, die transkriptionelle Regulierung in jeden Zelltyp des Interesses zu regieren. Wir beschreiben die Anpassung der ATAC-Seq an primären menschlichen Th1 und Th2-Zellen.
ATAC-Seq geladen hyperaktiven Tn5 Transposase mit Adaptern für Next Generation Sequencing (NGS) Paare DNA-Fragmentierung mit tagging von DNA mit Adaptern (d.h. der Prozess "Tagmentation")1. Nach PCR-Amplifikation sind die daraus resultierenden DNA-Bibliotheken bereit für Next Generation Sequencing (Abbildung 1). Die bevorzugte Tagmentation von zugänglich Chromatin wird durch die Analyse der lokalen Bereicherung der ATAC-Seq Sequenzierung liest erkannt.
Die kurze Versuchsdurchführung und Voraussetzung für weniger Ausgangsmaterial, im Vergleich zu anderen Methoden zur Messung von Chromatin Zugänglichkeit und nucleosomal Positionierung z. B. DNase-Seq4und FAIRE Seq5MNase-Seq6, hat die Verwendung von ATAC-Seq in mehrere biologische Systeme, einschließlich menschliche Primärzellen1,7 und klinischen Proben8, sowie Einzeller9, Pflanzen10, Fruchtfliegen11 gefördert , und verschiedene Säugetiere12.
Die Identität der Transkription, die Faktoren, die an zugänglich Loci gebunden sind durch Analyse der Anreicherung von ihrer Bindung Sequenzmotive oder Kombination von ATAC-Seq mit Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (aufgedeckt werden können ChIP-seq). Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von Geschlecht-spezifische Transkriptionsfaktoren wichtig für die Blutbildung Maus13. Die unvoreingenommene und globale Natur der ATAC-Seq ermöglicht Studium der Genregulation in Organismen für die Reagenzien wie Antikörper gegen ChIP-Analyse nicht verfügbar sind. Z. B. evolutionäre Variationen in Cis-regulatorische Regionen wurden durch das Studium der kranialen Neuralleiste Zellen von Menschen und Schimpansen14, Entwicklungsstörungen Variationen in regulatorischen Elemente während der frühen Maus Embryogenese15, ändert in der regulatorischen Landschaft während einer Lebensdauer von einzelligen C. Owzarzaki9und die Entwicklung der Promotoren und Enhancer über 20 Säugetier Arten12.
ATAC-Seq war auch maßgeblich für die Messung von Chromatin Barrierefreiheit in Einzelzellen, so aufschlussreich Variabilität innerhalb Zell-Populationen, die in der Regel genomweite Studien7,16entzieht. ATAC-Seq kann darüber hinaus verwendet werden, um Veränderungen zu studieren, die in regulatorischen Regionen der DNA in Erkrankungen, auftreten, in denen Proben selten sind. Z. B. ATAC-Seq kann verwendet werden, um Veränderungen im regulatorischen Umfeld zu studieren, während der Beginn der akuten myeloischen Leukämie (AML)17 oder Ras-Onkogenese11angetrieben.

mapping genome-wide accessible chromatin in primary human t lymphocytes by atac-seq

Test für Transposase zugänglichen Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-Seq) ist eine Methode zur Identifizierung von offenen (zugänglich) Regionen des Chromatins. Diese Regionen sind regulatorische DNA-Elemente (z.B., Promotoren, Enhancer, Locus Kontrollregionen, Isolatoren), welche, die Transkription Faktoren binden. Mapping der zugänglichen Chromatin-Landschaft ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Aufdeckung aktive regulatorische Elemente über das Genom. Diese Informationen dienen als eine unvoreingenommene Ansatz für die Entdeckung, das Netz der relevanten Transkriptionsfaktoren und Mechanismen der Chromatinstruktur, die Genprogramme Ausdruck zu regieren. ATAC-Seq ist eine robuste und sensible Alternative zu DNase ich Überempfindlichkeit Analyse gepaart mit Next Generation Sequencing (DNase-Seq) und Formaldehyd-gestützte Isolation der regulatorischen Elemente (Jahrmarkt-Seq) für genomweite Analyse von Chromatin Zugänglichkeit und die Sequenzierung von micrococcal Nuklease-Sensitive Websites (MNase-Seq) Nukleosom Positionierung zu bestimmen. Wir präsentieren Ihnen ein detailliertes ATAC-Seq-Protokoll optimiert für menschliche primäre d.h. CD4 +-Lymphozyten Immunzellen (T-Helfer 1 (Th1) und Th2-Zellen). Dieses umfassende Protokoll beginnt mit Zellernte, dann beschreibt das molekulare Verfahren von Chromatin Tagmentation, Probenvorbereitung für die Sequenzierung der nächsten Generation, und auch Methoden und Überlegungen für die computergestützten Analysen verwendet, um interpretieren Sie die Ergebnisse. Um Zeit und Geld zu sparen, haben wir darüber hinaus eingeführt Qualitätskontrollmaßnahmen zur Bewertung der ATAC-Seq-Bibliothek vor der Sequenzierung. Wichtig ist, erlauben die Grundsätze, die in diesem Protokoll präsentiert seine Anpassung an anderen menschlichen immun- und nicht-immunen Primärzellen und Zell-Linien. Diese Richtlinien werden auch nützlich für Labore die nicht geübt im Umgang mit Next Generation Sequencing-Methoden sind.

Das Endergebnis dieses Protokolls ist ein ATAC-Seq-Bibliothek von in der Regel 3-20 ng/µL. Bei der Ausführung auf ein System für die DNA-Integrität-Analyse (siehe Tabelle der Materialien/Geräte), sie zeigen Leiter aussehen2 (Abb. 3A). Die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente ist in der Regel ~ 450-530 bp.
Richtige Qualitätskontrolle der ATAC-Seq-...

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Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Test für Transposase zugänglichen Chromatin gepaart mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-Seq) ist eine genomweite Methode zugänglich Chromatin aufzudecken. Dies ist ein Schritt für Schritt ATAC-Seq-Protokoll von molekularen bis die abschließende computergestützte Analyse, optimiert für menschlichen Lymphozyten (Th1/Th2). Dieses Protokoll kann von Wissenschaftlern ohne Vorkenntnisse in Next Generation Sequencing Methoden übernommen werden.

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Forschung

Genetik

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-Seq-Assay mit niedrigen mitochondriale DNA Kontamination von primären menschlichen CD4 + T-Lymphozyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...