Name: detection of mitochondria membrane potential to study clic4 knockdown-induced hn4 cell apoptosis in vitro
Uploaded: 2018-07-17T13:00:00
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Wir danken Herrn Chao Fang für die Zellkultur. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81570403, 81371284); Anhui Provinz Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Herausragende junge Ermittler der medizinischen Universität Anhui; Rahmenprogramm für exzellente junge Talente an Universitäten der Provinz Anhui.

(1) Zell-Kultur und Transfektion
<ol><li>
Zellkultur Hinweis: HN4, ein lokal-Zell-Linie wurde von Patienten mit lokal14abgeleitet.<ol>
<li>Kultur HN4 Zellen in der Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose) mit 10 % fötalen Rinderserum und Antibiotika (100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin) ergänzt. Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zelle Transfektion
	<ol>
<li>Einen Tag vor Transfektion, Pla...

<ol>
	<li>Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+hypoxia+protects+cerebral+mitochondrial+function+from+calcium+overload.">Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload.</a> Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).</li><li>Gogol, P., Trzci&#324;ska, M., Bry&#322;a, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility,+mitochondrial+membrane+potential+and+ATP+content+of+rabbit+spermatozoa+stored+in+extender+supplemented+with+GnRH+analogue+[des-Gly10,+D-Ala6]-LH-RH+ethylamide.">Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide.</a> Pol J Vet Sci. 17, (2014).</li><li>Machiels, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+management+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).</li><li>Behera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+therapy+with+taxane+versus+non-taxane+containing+regimens+in+locally+advanced+squamous+cell+carcinomas+of+the+head+and+neck+(SCCHN):+a+systematic+review.">Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review.</a> Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).</li><li>Pancari, P., Mehra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).</li><li>Peretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channels+in+cancer:+Focus+on+chloride+intracellular+channel+1+and+4+(CLIC1+AND+CLIC4)+proteins+in+tumor+development+and+as+novel+therapeutic+targets.">Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets.</a> Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).</li><li>Jentsch, T. 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S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. 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Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. 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S., Ha, T. J., Yoon, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanidin-3-glucoside+Inhibits+ATP-induced+Intracellular+Free+Ca(2+)+Concentration,+ROS+Formation+and+Mitochondrial+Depolarization+in+PC12+Cells.">Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).</li><li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practices+of+laser+scanning+confocal+microscopy.">Principles and practices of laser scanning confocal microscopy.</a> Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).</li><li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+boldly+glow...+applications+of+laser+scanning+confocal+microscopy+in+developmental+biology.">To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).</li></ol>

Es ist gut dokumentiert, dass Cl− Kanäle wesentlich bei der Aufrechterhaltung der Hämostase der internen Umwelt und spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Proliferation und Apoptose15,16. Verständnis der Beziehung zwischen Ionen-Kanal gezielt eingreifen und Apoptose ist daher von großer Bedarf und Bedeutung, einen bessere therapeutische Ansatz für verschiedene Krebsarten17zu finden. Mitochondrien behalten Sie den normale...

Rh123 ist ein kationischen Fluoreszenz-Farbstoff, dient als Indikator für transmembranen Potenzial. Rh123 ist in der Lage, die Zellmembran durchdringen und die Eingabe der mitochondrialen Matrix abhängig von der Potentialdifferenz von innerhalb und außerhalb der Membran-1. Apoptose führt um zu Schäden der Mitochondrien-Membran Integrität. Die Mitochondrium Permeabilität Übergang Pore (MPTP) öffnet und zum Zusammenbruch des MMP, wodurch wiederum die Freisetzung von Rh123 an der Außenseite der Mitochondrien führen. Zu guter Letzt wird stärkeres Signal grün fluoreszieren unter Fluoreszenzmikroskop erkannt werden. Es ist gut dokumentiert, dass die Erschöpfung der MMP und erhöhten Membranpermeabilität sind frühe Anzeichen von Zelle Apoptosis2. Daher kann Rh123 auf die Erkennung von MMP-Änderung und dem Auftreten von zellapoptose angewendet werden.
Als die 6. häufigste Karzinom in der Welt verschlechtert Kopf-und halskrebs stark eine Person Gesundheit3. Obwohl viele Ansätze in den letzten Jahren entwickelt wurden, ist klinische Ergebnisse der Behandlung von Patienten mit Kopf- und Halsbereich Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) noch nicht ideal4. Erkundung neue Therapiemethoden kann die Behandlung für lokal5verbessern. Ionenkanäle, die mit zahlreichen biologischen Prozessen anzeigen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von verschiedenen Krebsarten6 Teilweise oder vollständige Teilnahme der Cl– Kanäle sind sehr verschiedene Eigenschaften der neoplastischen Transformation einschließlich aktive Migration, hohe Rate der Verbreitung und Invasivität beteiligt. Vor diesem Hintergrund wurde die CLIC, ein neuartiges Protein-Familie, als eine viel versprechende Klasse von therapeutischen Ziele für Krebs Behandlung6,7aufgeführt. Neuere Studien haben gezeigt, die Mitglieder der CLIC-Familie, einschließlich CLIC1, CLIC4 und CLIC5, zu lokalisieren, zu kardialen Mitochondrien und reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Niveau hochreguliert durch CLIC5, zeigt die funktionale Rolle der mitochondrialen befindet sich Cl - in der Apoptotic Antwort8Kanäle. CLIC4, ein Mitglieder der CLIC-Familie (auch bekannt als MtCLIC, P64H1 und RS43), wurde weitgehend für seine Apoptotic Verordnung Eigenschaften in Krebszellen und subzelluläre Lage einschließlich Golgi, endoplasmatische Retikulum und Mitochondrium beim Menschen untersucht Keratinozyten7,9,10. Das Expressionsprofil des CLIC4 wurde von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), P53 und äußeren Reiz geregelt. Überexpression und Downregulation der CLIC4 auslösen eine apoptotische Reaktion vor allem durch den mitochondrialen Weg begleitet mit dem Ungleichgewicht von Bcl-2 Familie Mitglieder, Aktivierung der Caspase-Kaskade und Freisetzung von Cytochrom C11, 12 , 13. daher MMP Messung ist entscheidend für die CLIC4 im Zusammenhang mit Apoptose zu erkunden und Rh123 dient als Indikator ideale Fluoreszenz.
Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Detektion von MMP CLIC4 Zuschlag-induzierten Apoptose in HN4 Zellen zu studieren. Rh123 wird als Fluoreszenz Sonde verwendet, um die Änderung der MMP zu beobachten. Unter gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop und konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop kann die Echtzeit-Schwankung der MMP gelöst werden. Wir diskutieren die Vorzüge und Grenzen der Anwendung der konfokalen Laser-scanning Fluoreszenzmikroskop im Detail und auch mit anderen Methoden vergleichen. Dieses Protokoll kann auch auf andere Apoptose-bezogene Studien angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1296px;" width="1294">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">HNSCC cells</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:183px;">CRL-3241</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polylysine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P4981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Specific siRNA for human CLIC4</td>
			<td>Biomics</td>
			<td>NM_013943</td>
			<td style="width:559px;">(accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 
			5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rhodamine 123, FluoroPure grede</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R22420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:372px;">Dulbecco&#8217;smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0201</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td>LEICA.SP5-DMI6000-DIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Metaflour, V7.5.0.0</td>
			<td>Universal Imaging Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica application suite, v2.6.0.7266</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft office Excel 2007</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sigma Plot 12.5</td>
			<td>Systat Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mitochondria membrane potential to study clic4 knockdown-induced hn4 cell apoptosis in vitro

Erschöpfung des mitochondrialen Membranpotentials (MMP, ΔΨm) gilt als das früheste Ereignis in der Apoptose-Kaskade. Es kommt sogar vor nuklearen apoptotische Merkmale, einschließlich der Chromatin-Kondensation und DNA-Bruch. Sobald der MMP zusammenbricht, zellapoptose irreversibel einleiten werden. Eine Reihe von lipophilen kationischen Farbstoffen kann durch die Zellmembran passieren und Aggregieren innerhalb der Matrix der Mitochondrien und dienen als Fluoreszenz Marker, MMP Veränderung zu bewerten. Als eines der sechs Mitglieder der CL– intrazelluläre Kanal (CLIC) Familie beteiligt CLIC4 Apoptotic zellprozess vor allem durch den mitochondrialen Weg. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der MMP durch monitoring der Fluoreszenz Fluktuation von Rhodamin 123 (Rh123), durch die wir, Apoptose induziert durch CLIC4 Zuschlag studieren. Wir diskutieren die Vorzüge und Grenzen der Anwendung der konfokalen Laser-scanning- und normal Fluoreszenzmikroskop im Detail und auch mit anderen Methoden vergleichen.

In der vorliegenden Studie wurde Rh123 angewandt, um die MMP zu erkennen. Zunächst wurden für die folgenden Fluoreszenz Färbung Experimente HN4 Zellen kultiviert. Pinzette wurden zur kreisförmige Deckgläsern unter 6-Well-Platten (Abb. 1A) zu legen. Die Deckgläsern wurden beschichtet mit Polylysin für 5 min und dann die Polylysin per Pipette (Abbildung 1B) entfernt. Dann HN4 Zellen wurden t...

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Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Anwendung von Rhodamin 123 zu identifizieren das mitochondriale Membranpotential (MMP) und CLIC4 Zuschlag-induzierte HN4 Zelle Apoptosis in-vitro-Studie. Unter gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop und konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop war die Änderung des Echtzeit-die MMP aufgezeichnet.

Erkennung von Mitochondrien-Membran-Potential, CLIC4 Knockdown-induzierte HN4 Zelle Apoptosis In-vitro- Studie

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Research

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