Name: detection of mitochondria membrane potential to study clic4 knockdown-induced hn4 cell apoptosis in vitro
Uploaded: 2018-07-17T13:00:00
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Gentilmente agradecemos Sr. Chao Fang para cultura de células. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação ciência Natural da China (Grant no. 81570403, 81371284); Fundação de Anhui Provincial de ciências naturais (Grant No. 1408085MH158); Excelente jovem investigador da universidade médica de Anhui; Programa de apoio para excelentes jovens talentos nas universidades da província de Anhui.

1. cultura e transfecção de células
<ol><li>
Cultura celular Nota: O HN4, uma linha de celular HNSCC, derivou-se de pacientes com HNSCC14.<ol>
<li>Células de cultura HN4 em de Dulbecco modificado Eagle suplementado (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL). Incube as células a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfecção celular
	<ol>
<li>Um dia...

<ol>
	<li>Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+hypoxia+protects+cerebral+mitochondrial+function+from+calcium+overload.">Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload.</a> Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).</li><li>Gogol, P., Trzci&#324;ska, M., Bry&#322;a, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility,+mitochondrial+membrane+potential+and+ATP+content+of+rabbit+spermatozoa+stored+in+extender+supplemented+with+GnRH+analogue+[des-Gly10,+D-Ala6]-LH-RH+ethylamide.">Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide.</a> Pol J Vet Sci. 17, (2014).</li><li>Machiels, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+management+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).</li><li>Behera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+therapy+with+taxane+versus+non-taxane+containing+regimens+in+locally+advanced+squamous+cell+carcinomas+of+the+head+and+neck+(SCCHN):+a+systematic+review.">Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review.</a> Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).</li><li>Pancari, P., Mehra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).</li><li>Peretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channels+in+cancer:+Focus+on+chloride+intracellular+channel+1+and+4+(CLIC1+AND+CLIC4)+proteins+in+tumor+development+and+as+novel+therapeutic+targets.">Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets.</a> Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).</li><li>Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. 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S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIC4,+an+intracellular+chloride+channel+protein,+is+a+novel+molecular+target+for+cancer+therapy.">CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy.</a> J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).</li><li>Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CLIC4+Enhances+Autophagy+and+Triggers+Mitochondrial+and+ER+Stress-Induced+Apoptosis+in+Human+Glioma+U251+Cells+under+Starvation.">Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation.</a> PloS one. 7, 39378 (2012).</li><li>Ponnalagu, D., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anion+Channels+of+Mitochondria.">Anion Channels of Mitochondria.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).</li><li>Leanza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+channels+and+cancer.">Intracellular ion channels and cancer.</a> Front Physiol. 4, 227 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. 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W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurological+perspective+on+mitochondrial+disease.">A neurological perspective on mitochondrial disease.</a> Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).</li><li>Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. 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S., Ha, T. J., Yoon, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanidin-3-glucoside+Inhibits+ATP-induced+Intracellular+Free+Ca(2+)+Concentration,+ROS+Formation+and+Mitochondrial+Depolarization+in+PC12+Cells.">Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).</li><li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practices+of+laser+scanning+confocal+microscopy.">Principles and practices of laser scanning confocal microscopy.</a> Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).</li><li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+boldly+glow...+applications+of+laser+scanning+confocal+microscopy+in+developmental+biology.">To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).</li></ol>

Está bem documentado que o Cl− canais são essenciais na manutenção da hemostasia do ambiente interno e desempenham um papel importante na proliferação celular e apoptose15,16. Portanto, compreender a relação entre a intervenção orientada para o canal de íon e apoptose é de grande necessidade e importância de encontrar uma melhor abordagem terapêutica para vários cânceres17. As mitocôndrias mantenham estado bio...

Rh123 é um corante catiônico de fluorescência, que serve como um indicador para o potencial transmembrana. Rh123 é capaz de penetrar a membrana celular e inserindo a matriz mitocondrial, dependendo da diferença de potencial dentro e fora da membrana1. Apoptose leva a danos da integridade da membrana mitocondrial. O poro de transição de permeabilidade de mitocôndria (MPTP) abrirá e ao colapso do MMP, que por sua vez, resulta na liberação de Rh123 para fora das mitocôndrias. Finalmente, sinal mais forte fluorescência verde será detectado sob microscópio de fluorescência. Está bem documentado que a depleção do MMP e permeabilidade da membrana elevados são sinais precoces de celular apoptose2. Portanto, o Rh123 pode ser aplicada para a detecção de mudança MMP e a ocorrência de apoptose celular.
Como o 6ª carcinoma mais comum no mundo, câncer de cabeça e pescoço deteriora gravemente saúde3 uma pessoa. Embora muitas abordagens foram desenvolvidas nos últimos anos, resultados clínicos do tratamento para pacientes que sofrem de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é ainda não é o ideal4. Explorar novos métodos terapêuticos pode melhorar o tratamento para HNSCC5. Canais iônicos envolvendo inúmeros processos biológicos exibem um papel importante no desenvolvimento de diferentes tipos de câncer6. Participação parcial ou total dos canais de Cl– são altamente envolvidos em várias propriedades de transformação neoplásica, incluindo migração ativa, alta taxa de proliferação e invasão. Neste contexto, o CLIC, uma família de proteínas romance, foi listado como uma promissora classe de alvos terapêuticos para o tratamento de câncer6,7. Estudos recentes têm revelado que membros da família CLIC, incluindo CLIC1, CLIC4 e CLIC5, localizar a cardíaca mitocondrial e o nível de (ROS) de espécies reativas de oxigênio é upregulated por CLIC5, indicando o papel funcional de mitocondrial-localizado Cl - canais na resposta apoptótica8. CLIC4, um membros da família CLIC (também conhecido como mtCLIC, P64H1 e RS43), tem sido mais extensivamente estudada pelas suas propriedades de regulamento de apoptose em células cancerosas e Localização subcellular incluindo mitocôndria, retículo endoplasmático e Golgi em humanos queratinócitos7,9,10. O perfil de expressão de CLIC4 foi regulamentado pelo fator de necrose tumoral-α (TNF-α), P53 e estímulo externo. Superexpressão e downregulation de CLIC4 provocar uma resposta de apoptotic principalmente através da via mitocondrial, acompanhada com o desequilíbrio dos membros da família Bcl-2, ativação da cascata das caspases e liberação de citocromo C11, 12 , 13. portanto, medição de MMP é crucial para explorar a apoptose relacionadas com CLIC4, e Rh123 serve como um indicador de fluorescência ideal.
O presente estudo descreve um protocolo detalhado para a detecção de MMP para estudar CLIC4 induzida por nocaute apoptose nas células HN4. Rh123 é usado como uma sonda de fluorescência para observar a mudança do MMP. Sob o microscópio de fluorescência comum e microscópio de fluorescência digitalização laser confocal, a flutuação em tempo real do MMP pode ser resolvida. Podemos discutir as vantagens e limitações da aplicação do laser confocal microscópio de fluorescência em detalhe e também compará-lo com outros métodos. Este protocolo também pode ser aplicado a outros estudos relacionados ao apoptosis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1296px;" width="1294">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">HNSCC cells</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:183px;">CRL-3241</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polylysine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P4981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Specific siRNA for human CLIC4</td>
			<td>Biomics</td>
			<td>NM_013943</td>
			<td style="width:559px;">(accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 
			5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rhodamine 123, FluoroPure grede</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R22420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:372px;">Dulbecco&#8217;smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0201</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td>LEICA.SP5-DMI6000-DIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Metaflour, V7.5.0.0</td>
			<td>Universal Imaging Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica application suite, v2.6.0.7266</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft office Excel 2007</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sigma Plot 12.5</td>
			<td>Systat Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mitochondria membrane potential to study clic4 knockdown-induced hn4 cell apoptosis in vitro

Depleção do potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨm) é considerada o evento mais antigo em cascata apoptótica. Mesmo ocorre antes do nucleares apoptotic características, incluindo a condensação da cromatina e quebra de DNA. Uma vez que os colapsos MMP, apoptose celular iniciará irreversivelmente. Uma série de corantes catiônicos lipofílicos pode passar através da membrana celular e agregar dentro da matrix da mitocôndria e servir como marcador de fluorescência para avaliar mudança MMP. Como um dos seis membros da família canal intracelular (CLIC), o Cl– CLIC4 participa no processo de apoptose celular, principalmente através da via mitocondrial. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para medir MMP através de monitoramento a flutuação de fluorescência de rodamina 123 (Rh123), através da qual estudamos a apoptose induzida por nocaute de CLIC4. Podemos discutir as vantagens e limitações da aplicação do laser confocal varredura e microscópio de fluorescência normal em detalhe e também compará-lo com outros métodos.

No presente estudo, aplicou-se Rh123 para detectar o MMP. Inicialmente, HN4 as células foram cultivadas por fluorescência seguinte experiências de coloração. Pinça foram usada para colocar lamelas circulares no fundo do poço-6 placas (Figura 1A). As lamelas foram revestidas com polylysine por 5 min... e então o polylysine removido através da pipeta (Figura 1B). Então as células HN4 for...

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Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para a aplicação de rodamina 123 para identificar o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e estudar CLIC4 induzida por nocaute HN4 celular apoptose em vitro. Sob o microscópio de fluorescência comum e microscópio de fluorescência digitalização laser confocal, registou-se a mudança em tempo real do MMP.

Deteção do potencial de membrana mitocôndria para estudar CLIC4 HN4 induzida em Knockdown celular apoptose em Vitro

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