Name: immunostaining for dna modifications: computational analysis of confocal images
Uploaded: 2017-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images at JoVE.com

O trabalho foi apoiado pela biotecnologia e Conselho de pesquisa de ciências biológicas [BB/N005759/1 para A.R.]. NRFH foi financiado pelo Rosetrees Trust e o Graham Trust [A1130 / M546]. O microscópio Zeiss Elyra PS.1, o processamento de computadores e software foram financiados pelo BB/L013827/1 do BBSRC (multidisciplinar Super resolução microscopia facilidade na concessão de Nottingham University)

1. geração de imagens Confocal <ol><li>em preparação para a análise das formas modificadas de citosina, executar immunohistochemical coloração conforme descrito por Abakir et al 34.</li> <li>realizar imagens de slides para fora usando um microscópio e salvar arquivos em um formato LSM. 
	Nota: Quando comparando a intensidade perfis entre as amostras, os valores usados para o poder do laser e ganho para cada canal devem ser mantida em toda a imagem, tendo o procedimento para permitir a comparação direta na fase de análise de imagem.</li>
</ol> 2. Geração de parcelas de intensidade 2,5 D <ol><li>abrir o software (por exemplo, Zen preto) e selecione &#39; Image Processing &#39;.</li>
	<li>Vá para o menu arquivo e selecione abrir. Selecione a imagem que requer processamento.</li>
	<li>Clique no &#39; Mostrar tudo &#39; abaixo da imagem para tornar visível a todos os controles gráficos. Na metade inferior da tela existem três guias; &#39; Dimensões &#39;, &#39; Display &#39; e &#39; gráficos &#39;, selecione o &#39; gráficos &#39; Tab
	<ol><li>Escolher o &#39; retângulo &#39; ferramenta para selecionar núcleos da área pretendida.</li>
		<li>Select &#39; cortar a região &#39; para recortar a imagem. Isso irá gerar uma nova imagem para a região recortada em uma guia separada</li>
		<li>Vá ao menu arquivo e selecione salvar como dar o um nome de arquivo e salvar como um arquivo LSM ou CZI.</li>
	</ol></li> <li>Abrir software (por exemplo, azul de Zen) e selecione o &#39; Zen mesa &#39;.</li>
	<li>Enviar a imagem recortada do Zen preto para Zen azul, selecionando o arquivo e clicar no menu arquivo e selecione Enviar para edição 2012 Zen-azul. A imagem recortada em seguida abrirá no programa relevante. 
	Nota: O arquivo de imagem é transferido porque o recurso de trama de intensidade 2,5 D no Zen preto 2012 não exibir imagens de canais múltiplos simultaneamente.</li>
	<li>o lado esquerdo da imagem, escolha a guia que rotulados &#39; 2.5D &#39;, isto permite a visualização da imagem em 2.5 D. Clique &#39; Mostrar tudo &#39; para tornar visível a todos os controles gráficos.</li>
	Configurações de visualização de Alter usando quatro barras cinzentas situadas à esquerda e abaixo da imagem de <li>. 
	Nota: bar mão esquerda, parte superior da tela = zoom. Barra de mão esquerda, parte inferior da tela = imagem de volta no eixo. Parte inferior da tela, mão esquerda barra = rotação da imagem. Inferior da tela, direita mão bar = expandir e contrair escala bares.</li>
	<li>Garantir que render o modo selecionado é superfície como esta dá a melhor visualização dos picos individuais.</li>
	<li>Alteram a grade distância alterando a porcentagem, menor a porcentagem mais definidos cada pico individual.</li>
	<li>Para salvar a imagem de 2,5 D, primeiro ocultar a lista de arquivos no lado direito e as ferramentas gráficas abaixo da imagem clicando na seta cinza abaixo o enredo de 2,5 D (próximo a &#39; mostrar todos os &#39;), isto irá ocultar as guias gráficas permitindo a imagem expandir para preencher o scree s. para salvar a trama de 2,5 D, pressione a &#39; PrtSc &#39; chave no teclado. Isto irá capturar uma captura de tela do visor. Cole a imagem no Microsoft Paint e cortar a imagem antes de salvar.</li>
</ol> 3. Criação de perfil de intensidade <ol><li>abrir o software (por exemplo, Zen preto) e selecione Image Processing.</li>
	<li>Vá para o menu arquivo e selecione abrir. Selecione a imagem que requer processamento.</li>
	<li>Como a imagem será exibida na tela, no lado esquerdo da imagem, selecione na guia rotulada &#39; perfil &#39;.</li>
	<li>Na parte inferior metade da tela Selecione (assinalar) as &#39; Mostrar tudo &#39; guia. Isso permitirá o acesso a todas as opções de formatação.</li>
	<li>Na metade inferior da tela existem três guias; &#39; dimensões &#39;, &#39; Display &#39; e &#39; ProfileƆ selecione &#39; perfil &#39; e selecione (marque) o &#39; tabela &#39; caixa. Selecione o &#39; seta &#39; botão.</li>
	<li>Na imagem, use o mouse para selecionar um ponto de início e arraste o mouse sobre uma série contínua de células. Solte o mouse para produzir uma trama de intensidade para as células ao longo da linha; Além da tabela será preenchida com dados de medição de intensidade para os pixels ao longo da linha para cada comprimento de onda. 
	Nota: A tabela fornecerá a distância (µm), na qual pixel é lido intensidade da fluorescência vermelha, verde e azul.</li>
	<li>Para exportar esses dados, clique direito sobre a tabela, selecione &#39; salvar tabela &#8230; &#39; e salve em um local apropriado como um arquivo. txt.</li>
	<li>Para salvar a imagem de perfil de intensidade selecionada, selecione o menu arquivo e selecione &#39; exportação &#8230; &#39;. Na janela pop-up, escolha &#39; com a tag arquivo de imagem (formato) &#39; e &#39; conteúdo da janela de imagem - único painel (dados) &#39; seguida clicando &#39; selecione nome do arquivo e salvar &#8230; &#39; escolher um local apropriado e clique em &#39; salvar &#39;.</li>
	<li>Repita o processo para cada perfil individual de intensidade dependendo do campos de visão e o número de perfis para analisar.</li>
	<li>Intensidade de importar perfis de dados salvos (ver 3.7) e analisar em uma planilha, seguida de análise estatística.</li>
</ol> 4. Análise de localização co <ol><li>abrir o software e selecione &#39; processamento de imagem &#39;.</li>
	<li>Vá para o menu arquivo e selecione abrir. Selecione a imagem que requer processamento.</li>
	<li>Como a imagem será exibida na tela, no lado esquerdo da imagem, selecione na guia rotulada &#39; Coloc &#39;.</li>
	<li>Na parte inferior metade da tela Selecione (assinalar) as &#39; Mostrar tudo &#39; guia. Isso permitirá o acesso a todas as opções de formatação.</li>
	<li>Na metade inferior da tela, existem quatro abas; &#39; dimensões &#39;, &#39; Display &#39;, &#39; gráficos &#39; e &#39; ColocalizationƆ selecione &#39; Colocalization &#39; e marque a caixa para &#39; tabela &#39; e &#39; imagem &#39;.
	<ol><li>Selecione o terceiro ícone ao longo na parte superior dessa guia (Bezier próximo texto será exibido quando o mouse passa sobre a ferramenta), então use esta ferramenta para cercar um único núcleo, valores para esta vontade de núcleos então aparecem na tabela. 
		Nota: Para cada círculo núcleos um gráfico de dispersão é produzido para vermelho contra fluorescência verde que é visualizado no painel da esquerda na tela. O eixo é então movido para células dependendo o limiar da porta. Como os núcleos de interesse são selecionados manualmente nas imagens, ajustar os limiares associados acima de zero não é necessária. Todos os valores de intensidade de pixel observados dentro dos perímetros nucleares são considerados como sinal positivo.</li>
	</ol></li> <li>Repita este processo selecionando o terceiro ícone na guia e circundando núcleos subsequentes até que o conjunto de dados é concluído.</li>
	<li>Para exportar esses dados, clique com o botão direito em cima da mesa, selecione salvar tabela e salve em um local apropriado.</li>
	<li>Para salvar a imagem colocalization, selecione o menu arquivo e selecione &#39; exportação &#8230; &#39; em seguida, escolha; Com a tag arquivo de imagem (formato) e &#39; conteúdo da janela de imagem &#8211; único avião (dados) &#39; seguida clicando em &#39; selecione nome do arquivo e salvar &#8230; &#39;, escolha um local apropriado e clique em &#39; salvar &#39;.</li>
	<li>Plotar colocalization dados em uma planilha, seguido de análise estatística.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation:+II.+The+symmetry+of+methylated+sites+supports+semi-conservative+copying+of+the+methylation+pattern.">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern.</a> J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).</li><li>Youssoufian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+mutations+in+haemophilia+A+give+evidence+for+CpG+mutation+hotspots.">Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots.</a> Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).</li><li>Holliday, R., Pugh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+modification+mechanisms+and+gene+activity+during+development.">DNA modification mechanisms and gene activity during development.</a> Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).</li><li>Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+hypomethylation+of+DNA+and+expression+of+globin+genes+in+Friend+erythroleukemia+cells.">Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells.</a> European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).</li><li>Bird, A. P., Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation:+I.+The+methylation+pattern+in+ribosomal+DNA+from+Xenopus+laevis.">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis.</a> J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).</li><li>Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operation+and+communication+between+the+human+maintenance+and+de+novo+DNA+(cytosine-5)+methyltransferases.">Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases.</a> EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).</li><li>Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+de+novo+methylation.">Dissecting de novo methylation.</a> Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).</li><li>Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development.">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li><li>Eckhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling+of+human+chromosomes+6,+20+and+22.">DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22.</a> Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).</li><li>Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -. T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methyltransferase+loading,+but+not+de+novo+methylation,+is+an+oocyte-autonomous+process+stimulated+by+SCF+signalling.">DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling.</a> Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).</li><li>Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -. U., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeting+sequence+directs+DNA+methyltransferase+to+sites+of+DNA+replication+in+mammalian+nuclei.">A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei.</a> Cell. 71 (5), 865-873 (1992).</li><li>Jones, P. A., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+differentiation,+cytidine+analogs+and+DNA+methylation.">Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation.</a> Cell. 20 (1), 85-93 (1980).</li><li>J&#228;hner, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development. , 189-219 (1984).</li><li>Chalitchagorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+pattern+of+LINE-1+methylation+level+in+normal+tissues+and+the+association+with+carcinogenesis.">Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis.</a> Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).</li><li>Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnmt3a+and+Dnmt1+functionally+cooperate+during+de+novo+methylation+of+DNA.">Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA.</a> Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).</li><li>Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+and+sequence+specificity+of+a+eukaryotic+DNA+methylase.">Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase.</a> Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).</li><li>Dean, W., Santos, F., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+in+early+mammalian+development+and+following+somatic+nuclear+transfer.">Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).</li><li>Wu, S. C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+DNA+demethylation:+many+roads+lead+to+Rome.">Active DNA demethylation: many roads lead to Rome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine.">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Formylcytosine+can+be+a+stable+DNA+modification+in+mammals.">5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals.</a> Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).</li><li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+is+a+predominantly+stable+DNA+modification.">5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification.</a> Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).</li><li>Lurlaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome-wide+profiling+reveals+a+tissue-specific+role+for+5-formylcytosine.">In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine.</a> Genome Biol. 17 (1), 141 (2016).</li><li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributive+Processing+by+the+Iron+(II)/&#945;-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases.">Distributive Processing by the Iron (II)/&#945;-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).</li><li>He, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Herman, J. G., Graff, J. R., My&#246;h&#228;nen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-specific+PCR:+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands.">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li><li>Nagae, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+demethylation+in+CpG-poor+promoters+during+cellular+differentiation.">Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation.</a> Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+ES+cells+and+during+differentiation.">Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation.</a> Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).</li><li>Jin, S. -. G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+human+brain.">Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+DNA+6mA+methylation+during+early+embryogenesis+of+zebrafish+and+pig.">Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Wu, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+on+N6-adenine+in+embryonic+stem+cells.">DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li><li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PloS one. 5 (12), e15367 (2010).</li><li>Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue. , 125-137 (2016).</li><li>Alioui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Carboxylcytosine+is+localized+to+euchromatic+regions+in+the+nuclei+of+follicular+cells+in+axolotl+ovary.">5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary.</a> Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).</li><li>Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+two+forms+of+DNA+methylation+in+the+brain.">Diversity of two forms of DNA methylation in the brain.</a> Front Genet. 5, 46 (2014).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).</li><li>Lachmanovich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localization+analysis+of+complex+formation+among+membrane+proteins+by+computerized+fluorescence+microscopy:+application+to+immunofluorescence+co-patching+studies.">Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies.</a> J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse potenciais foram divulgados.

Este protocolo descreve o processo gradual de gerar representações visuais de alterações de DNA dentro de núcleos. Ao mesmo tempo sensível e impactantes, estas técnicas possuem uma série de limitações.
É necessário enfatizar que plota os dados gerados a partir de 2,5 D, perfis de intensidade de sinal e o colocalization análise semi-quantitativa na natureza. Devido a iluminação ponto a ponto da amostra durante a aquisição de imagens no microscópio confocal de varredura a laser, registam-se as intensidades de sinal absoluto de cada canal. No entanto, estes não são magnitudes absoluta de 5hmC e 5caC ser detectado e só representam indicações da presença, ausência ou escala destas marcas epigenéticas.
Devido à natureza repetitiva de amplificações do sinal, limitações consistentes com a magnitude da maquinaria aplicado para melhorar o sinal inevitavelmente confundem aproximações da verdadeira física ocupação genômica dessas marcas34. A verdadeira localização de genômica destas marcas pode ser obscurecida por estas proteínas volumosas, que fisicamente ocupam áreas unresolvable nem nos limites de resolução ideal confocal de 200-300 nm34. Além disso, as intensidades de sinal dos canais individuais para cada marca não podem ser comparadas entre si devido a diferenças na sensibilidade do anticorpo e fluoróforo conjugação34. No entanto as informações obtidas com imagem lança luz sobre a organização espacial e temporal das marcas de genômica.
Para a quantificação exata dos sinais 5hmC e 5caC, núcleos são destacados e rodeados contra o corante de contraste DAPI, claramente, demarcando a região a ser analisada. Este procedimento dispensa a exigência para calibrar limiares associados como ruído de fundo é desconsiderado, através do processo manual de seleção de núcleos1. Uma automatização deste processo pode ser alcançada no mais recente software que permite a segmentação nuclear a ser executada. Enquanto os pacotes de software livre alternativo como FIJI estão disponíveis para análise colocalization, inconvenientes, tais como a obrigatoriedade de converter imagens em formatos binários de 8 bits, mascaramento de imagens e introduzir dados de exclusão de tamanho para selecionar regiões de interesse limite o a acessibilidade dos utilizadores deste programa. Além disso, Considerando que global limitado de níveis de 5hmC e 5caC no genoma juntamente com sua localização predominante em regiões de eucromatina e depleção de sequências genomic da CpG, em geral, circundando manual de núcleos introduz o usuário-viés. Portanto, o destaque de núcleos automaticamente assume todos os eventos que ocorrem dentro da região demarcada para ser positivo e desconsidera quaisquer pixels de fundo que podem estar presentes. Assim, analisar imagens com base na intensidade do pixel pode ser mais significativo. Esses fatores são importantes quando se considera o uso do coeficiente de colocalization do Mander para analisar o grau de sobreposição espacial entre dois sinais, independentemente da sua intensidade de sinal como se opor ao coeficiente de correlação de Pearson, que assume um relação linear entre os sinais.
Em geral, as técnicas descritas aqui carregam o tema da representação visual de dados biológicos em um formato intuitivo. Enquanto análise semi-quantitativa de imagem não pode substituir técnicas poderosas tais como espectrometria de massa em termos de sensibilidade ou genoma único resolução base larga sequenciamento, ele fornece dados complementares, permitindo inferências e hipóteses para ser concebidos a partir da análise de imagens com precisão.

Metilação do DNA, um mecanismo bem documentado associado com regulamento transcriptional implica modificação de resíduos de citosina em uma 5'-citosina-fosfato-guanina-3' contexto de dinucleótido (CpG) através da adição de um grupo metilo (-CH3) ao 5... átomo de carbono do anel pirimidina citosina para formar 5-metilcitosina (5mC)1. Nos mamíferos, aproximadamente 70% das CpGs são misturados que constitui apenas 1% dos seus genomas, como eles estão esgotados de capicuas sequência devido à propensão mutagénicas 5mC para sofrer espontaneamente a timina2. Presença de grupos metil em sequências de promotor do gene mostram forte correlação com repressão transcriptional em vertebrados3,4,5. Além desses grupos metilo é catalisada por altamente conservadas DNA metiltransferase (DNMT) enzimas DNMT3a, 3b e 3 L e DNMT1 que modificar CpG metiladas em contextos de metilação de novo e manutenção, respectivamente6. Expressão Dnmt3a/B é elevada durante o desenvolvimento de células-tronco embrionárias e epiblasto; no entanto sua expressão diminuída é observada após o compromisso de linhagem celular pluripotentes para destinos somáticos durante a diferenciação8. Enquanto o compartilhamento de redundância funcional, DNMT3a e 3b exibem padrões de expressão tecido-específica, com 3a detectado uniformemente em embriões de rato mas 3b localizadas predominantemente neuroectoderma e ectoderme gonadotrofina tecidos8.
Assinaturas de metilação podem ser herdadas durante a mitose e meiose10. Metilação de manutenção envolve a modificação de DNMT1 facilitada de resíduos de citosina CpG existentes em palíndromos hemi-misturado em dupla-hélice DNA11. DNMT1 liga DNA em replicação bifurca11 e consequentemente, metilação genômica níveis de pico durante a fase S do ciclo celular12. DNMT1 mistura sem modificações cytosines desse modo distinguindo de DNA recém sintetizada, promovendo a inativação do cromossomo x e manutenção de perfis de repressão transcriptional13. Através do reconhecimento de sequências de DNA CpG hemi-misturado, DNMT1 mantém padrões estabelecidos de metilação demarcados por novo de metilação , por exemplo, repressão de longa Interspersed Nuclear elemento 1 (linha1) retrotransposon promotores para inibir sua propagação potencialmente cancerígenos14. Embora possua afinidade de ligação preferencial de DNA hemi-misturado, DNMT1 pode misturamos unmethylated CpG sequências de ilha (CGI) em células mutantes DNMT3a/b - / - , cumprindo um papel de metilação de emergência de novo 15 . Assim, devido à natureza semi conservador da replicação de DNA16, metilação de manutenção pode recapitular, fielmente, assinaturas de metilação de pai para filha célula17.
No entanto, para gene expressão ser modulado dinamicamente, repressiva metilação modificação deve ser apagado, que pode ser alcançado através de de mecanismos de desmetilação ativa e passiva18. As proteínas de dez-onze Translocase (TET) pertencente a uma família conservada de dioxigenase proteínas são capazes de oxidação iterativa de grupos metilo na CpG resíduos19. Estas proteínas de Tet, homólogas às proteínas de ligação de J-Base (JBP) descobertas em bruceii tripanossoma, reconhecer e ligar o ADN modificado bases, por exemplo, 5mC e oxigenar a estes resíduos 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5 - carboxylcytosine (5caC)20. Proteína de Tet facilitou a oxidação de 5mC resulta em mudança de conformação progressiva de metil às configurações de hidroxila, carbonila e carboxilato, porém 5fC e 5caC modificações podem ser sintetizadas directamente a partir da oxidação 5mC21, 22 , 23 , 24.
Indicação informativa da atividade de proteína TET na compreensão de sua regulação é estudar a distribuição e abundância de marcas de oxi-metil-citosina. 5mC significativa presença no pobres promotores CpG é detectável em contraste com unmethylated regiões ricas de CpG, sendo este último característico de CpG consoles de25. Através de tecidos, tecido maior metilação específica é observada no cérebro, testículos e sangue enquanto a mucosa oral apresentam maior hypomethylation, indicando um padrão de metilação diferencial ocorrendo no tecido específico promotores26.
Através de utilizando anti-5mC sensível e anti-5hmC anticorpos na seletiva de metilo/hidroximetil DNA imunoprecipitação (meDIP/hmeDIP) e sequenciamento de subsequentes alto throughput, Ficz et al demonstraram 5hmC alta ocupação no promotores, exões e linha-1 retrotransposon sequências que correlacionados com níveis de 5mC reduzida nesses locais no mouse embrionário tronco células27. Inversamente, maior enriquecimento de 5mC foi observado em sequências repetitivas satélite onde 5hmC presença foi limitada28. Estudos realizados no tecido do cérebro humano no lobo frontal revelaram 5hmC altamente significativo enriquecimento, quatro vezes maior do que em células-tronco embrionárias de rato28. Em concordância com as observações anteriores, sequenciamento de alto rendimento de lóbulo frontal tecido ilustrado maioria 55-59% do sinal de 5hmC localizadas na baixa densidade CpG regiões de promotor, 35-38% dentro de corpos de gene e cerca de 6% de ocupação no intergênica regiões. Em contraste, 5mC foi enriquecido em regiões intergênicas (25-26%) e mais alto dentro de corpos de gene (52-55%), mas a reduzida (22-24%) no promotor sequências29. Estes estudos indicam abundância de 5hmC em células-tronco embrionárias e tecidos somáticos, particularmente o cérebro, no entanto, as investigações em distribuições 5fC e 5caC são limitadas.
Curiosamente, recentemente descoberto em eucariontes, metilação de resíduos de adenina no nitrogênio a posição 6 (N.6) (6mA) exibir uma abundância de genômica perfil inverso ao de 5mC30. Observações de cromatografia líquida acoplada espectrometria de massa em tandem revelam 6mA níveis absolutos de existir em excesso no peixe-zebra e porcinos embriões adiantados em relação ao esperma com seus níveis (0,003% do genoma adenines) aumenta constantemente em cima de fertilização, atingindo o grau de desenvolvimento de mórula (33 vezes maior do que o esperma) e atingindo níveis somáticos de estado estacionário de 0,004% do genoma adenines31. Imunoprecipitação 6mA enriquecido de sequências de ADN demonstrou ocupação predominante (aproximadamente 80% enriquecimento) desta marca em regiões repetitivas elemento e iniciar transcriptional sites32. Estas observações contextualizam e valide a descoberta de 6mA demetilase nulo ecélulas-tronco mbryonic exibindo 6mA acumulada mediada linha-1 retrotransposon silenciar em comparação com elementos transcricionalmente ativos em células de sua. Estes dados sugerem uma função de regulação transcricional para 6mA33.
Enquanto conjugadas etiquetas bioquímicas acopladas para posteriores ensaios de mergulho indicam a presença ou ausência de derivados oxidados metilcitosina (oxi-mCs), eles não podem transmitir informações quantificáveis destas marcas34, ou distribuição espacial 35. um protocolo para sensível detecção imunoquímica de 5hmC e 5caC foi recentemente desenvolvido36. Este método de imunocoloração baseados em anticorpo secundário fluoróforo conjugado juntamente com utilizando microscopia confocal laser possui a vantagem exclusiva de fornecer localização visual destas modificações do DNA dentro das células, assim, enfatizando individuais positivamente ou negativamente coradas células correspondente com a heterogênea presença destas marcas. As intensidades de sinal absoluto de 5hmC e 5caC como amplificado por anticorpos conjugados permitem interpretações semi quantitativas a ser proposto sobre a magnitude e as posições destas marcas dentro do núcleo, por exemplo, regiões heterocromático e eucromatina 37 , 38. aqui descrita uma técnica de análise computacional de imagens de microscopia confocal. A geração da distribuição espacial de 2,5 D parcelas para exibir 5hmC distintas e picos de sinal 5caC por pixel e suas localizações dentro de núcleos é demonstrado. Histograma de 5hmC parcelas e 5caC perfis de intensidade de sinal podem ilustrar tendências em abundância destas marcas como os picos e depressões são plotados como canais separados de não-sobreposição. Finalmente, implementando a função colocalization, pode ser determinado o grau de proximidade de um sinal para outro e como resultado, suas respectivas coordenadas genômicas podem ser identificadas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen Black 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining for dna modifications: computational analysis of confocal images

Há várias décadas, 5-metilcitosina (5mC) foi pensado para ser a única modificação de DNA com um significado funcional em metazoários. A descoberta de oxidação enzimática de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC), bem como a detecção de N6-methyladenine (6mA) no DNA de organismos multicelulares fornecido adicionais graus de complexidade para a investigação epigenética. De acordo com um crescente corpo de evidências experimentais, essas modificações de DNA a novela podem desempenhar papéis específicos em diferentes processos celulares e do desenvolvimento. Importante, como algumas dessas marcas (e. g. 5hmC, 5caC e 5fC) exposição de tecido - e ocorrência de estágio específico do desenvolvimento em vertebrados, Imunoquímica representa uma importante ferramenta que permite a avaliação da distribuição espacial de modificações do DNA em diferentes contextos biológicos. Aqui, são descritos os métodos de análise computacional de modificações de DNA visualizado por imunocoloração seguida por microscopia confocal. Especificamente, a geração de 2,5 dimensão (2.5 D) parcelas de intensidade do sinal, sinal de intensidade perfis, quantificação de coloração de intensidade em várias células e determinação dos coeficientes de colocalization de sinal são mostradas. Coletivamente, estas técnicas podem ser operacionais em avaliar os níveis e a localização destas modificações de DNA no núcleo, contribuindo para elucidar seus papéis biológicos em metazoários.

Para determinar a distribuição espacial de 5hmC e 5caC em diferenciar os slides de immunostained hepática progenitores para essas modificações do DNA foi fotografada usando um microscópio.
Análise inicial da distribuição espacial destes oxi-mCs foi realizado através da geração de parcelas de intensidade 2,5 D (figura 1A, 1B). Os picos de vermelhos e verdes parecem ser bem definido com a presença limitada de laranja picos indicando apenas uma pequena sobreposição dos sinais 5caC e 5hmC. De acordo com estes resultados, os perfis para intensidades de 5hmC e 5caC na célula correspondente não fortemente coincidem com o outro (Figura 1). Isso ilustra que a 5caC e 5hmC apresentam padrões distintos de distribuição nuclear em progenitores hepáticos sugerindo essa oxidação Tet-dependente de 5mC conduz a geração de diferentes derivados oxidados desta alteração de DNA na cromatina específica regiões.
Para comparar os níveis de 5caC e 5hmC em Daoy medulloblastoma e BXD-1425EPN ependimoma células, imunocoloração para estes oxi-mCs foi executada em ambas as amostras em condições experimentais idênticas. Intensidades de sinais 5caC e 5hmC foram então comparadas em 20 perfis gerados por 3-5 células gravadas para cada linha de celular (Figura 2A-2D). A quantificação dos resultados revelou que BXD-1425EPN células apresentam níveis significativamente mais baixos de imunocoloração tanto 5hmC e 5caC, em comparação com células Daoy (Figura 2D).
Considerando os dois canais vermelho (5hmC) e verde (5caC) que pode ser indicado como R e G respectivamente, coeficiente de correlação de Pearson (PCC) descreve o grau de sobreposição espacial e segregação co de R &#38; G supondo que ambas as marcas existe em um linear relação com o outro, denotada por R estatística34. Quadratura do valor do PCC, denotado por R2 permite a medição da variação de intensidade de sinal verde que é influenciada pela intensidade de sinal vermelho34. Isso é supérfluo para nossa análise de localização co 5caC vs 5hmC.
Para examinar a distribuição espacial de 5caC e 5hmC em indiferenciado (Undiff) hiPSCs e endoderme hepática (HE24) de 24 horas após a indução, colocalization análise destas modificações do DNA foi realizada nas mesmas imagens confocal, com valores de R para 20 núcleos analisaram para cada linha de celular (Figura 3A-3 C).
A quantificação dos resultados demonstrou que o grau de colocalization é significativamente maior (P &#60; 0,05) em HE24 comparado com Undiff (Figura 3C). Isto pode ser atribuído à magnitude reduzida da presença de 5caC e, portanto, sua intensidade de sinal reduzido nas células Undiff.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig1.jpg"> 
Figura 1: coloração imuno-histoquímica de progenitores endoderme hepática em 72 horas pós indução de diferenciação. (A) co coloração de 5hmC (vermelho), 5caC (verde) e mancha de contador nuclear DAPI (azul). A seta tracejada branca 'B' denota a direção de criação de perfil amostrado através do núcleo, ilustrado em 1C. Barra de escala representa 5 µm. canal vermelho: ganhar 800, laser 1%. Canal verde: ganhar 750, laser 2.4%. Canal DAPI: ganhar 750, laser 2,6%. (B) 2,5 D lote de intensidade de sinais DAPI, 5caC e 5hmC. Picos individuais representam intensidades de sinal absoluto de cada pixel. Vistas mescladas e canais individuais são mostrados. (C) os perfis de intensidade de 5hmC, 5caC e DAPI sinais em progenitores hepáticas em 72 horas pós indução de diferenciação. Intensidades de pico foram gravadas ao longo das dimensões da seta tracejada branca 'B' e são indicadas ao longo do eixo x perfil de intensidade por uma seta tracejada preta. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig2.jpg"> 
Figura 2: análise de 5hmC e 5caC do sinal intensidades em Daoy medulloblastoma e linhas de células de ependimoma BXD-1425EPN. (A) imunofluorescência coloração de 5hmC (vermelho) e 5caC (verde) nas células Daoy e BXD-1425EPN. Imagens foram capturadas com 63 x óleo lente objetiva de imersão, ambos com as mesmas configurações. Vistas mescladas e canais individuais são mostrados. Barras de escala representam 10 µm. canal vermelho: ganhar 746, laser 1%. Canal verde: ganhar 750, laser 2.4%. Células Daoy (B) e (C) BXD-1425EPN individuais são expandidas em números adjacentes. Escala de barras para (B) e (C) representam 5 µm. (D) média intensidade de fluorescência de 5hmC vs 5caC sinais nas células Daoy e BXD-1425EPN (n = 20, SD). Significância foi avaliada por meio de um teste F e asteriscos teste t de duas amostras denotam estatisticamente significativos valores de p de * * como p &#60; 0,01 e * * * como p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig3.jpg"> 
Figura 3: análise Colocalization de sinais absolutos 5hmC e 5caC em hiPSCs indiferenciado (Undiff) comparado a endoderme hepática 24 horas células progenitoras pós-diferenciadas (HE24). Imagens de microscopia confocal do (A) indiferenciado, hiPSCs e HE24 (B) células manchadas para 5hmC (vermelho), 5caC (verde) e DAPI (azul). As células foram fotografadas com 63 X lente de imersão de óleo em configurações idênticas. 20 núcleos encircled ilustram as células colhidas amostras para análise de colocalization. Barras de escala representam 20 µm. canal vermelho: ganhar 800, laser 1%. Canal verde: ganhar 750, laser 2.4%. Canal DAPI: ganhar 750, laser 2,6%. (C) análise Colocalization da presença do sinal de 5caC dentro do alcance da proximidade de 5hmC em undiff e HE24 (n = 20, SD). Significância foi avaliada por meio de um teste F e asteriscos teste t de duas amostras denotam estatisticamente significativos valores de p de * p &#60; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

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