Name: generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Japan-samfund til fremme af videnskab [Grant numre 16 K 15860 til TM og 15 K 15777 til N.H.].

1. primer Design <ol><li>forberede 2-trins fusion PCR og verifikation af genet forstyrrelser primere. 
	Bemærk: Tabel 1 viser de primer sekvenser bruges i denne protokol. figur 1 viser et skematisk illustration af 2-trins fusion PCR-metoden bruges til at generere S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>Design primere for udskiftning af målområde i genom med spectinomycin-resistens gen (spc r) 7. ...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors.">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).</li><li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II.">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li><li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis.">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis.">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li></ol>

I denne protokol, skal primere for 1st PCR være konstrueret til at forstærke ca 1 kb opstrøms og nedstrøms flankerende regioner i målområde i genomet. Sådanne lange flankerende sekvenser er nødvendige for at forbedre effektiviteten af homologe rekombination.
Sekvenser af primere (op-reverse, nede-forward, spcRasmussen-fremad og spcRasmussen-omvendt) i denne protokol blev automatisk bestemmes baseret på webstedet af indarbejdelse af fo...

Gen funktion analyse involverer typisk en fænotypiske sammenligning mellem en vildtype stamme og en stamme, hvor et bestemt gen af interesse har været forstyrret. Dette gen-forstyrrelser teknik er blevet udnyttet til gen funktion analyser i en bred vifte af taxa, fra bakterier til pattedyr. En gen-forstyrrelser konstruktion er nødvendige for generation af gen-afbrød stammen; denne deoxyribonukleinsyre (DNA) konstruktion består af antibiotikaresistens-markørgen sammenvokset til upstream og downstream flankerende regioner af target-genet, og er indarbejdet i genom via homologe rekombination. Gen-afbrød stammen kan isoleres ved hjælp af selektivt medie, der indeholder antibiotika. Den konventionelle metode anvendes til opførelse af gen-afbrød stammen kræver komplekse trin, som forstærkning af target-genet ved polymerase kæde reaktion (PCR), ligatur af genet ind i en passende plasmid, fordøjelse med begrænsning enzymer, og religation til at indsætte antibiotika-resistens markørgen. Denne proces er tidskrævende, tager flere dage til flere uger, afhængigt af succesen af hvert trin. Desuden, er udformningen af forstyrrelser konstruktioner afhængig af begrænsning enzym websteder af target-genet. For at løse disse problemer, er blevet rapporteret PCR-baseret DNA splejsning metoder1,2 for udformningen af gen-forstyrret mutanter af Dictyostelium discoideum3 og Synechocystis sp. PCC68034 . I den nuværende undersøgelse, blev udviklet en metode til at generere en gen-forstyrret streptokok stamme i en relativt hurtig, letkøbt og billig måde, udnytter en modificeret PCR-baseret metode (udpeget 2-trins fusion PCR) for opførelsen af forstyrrelsen konstruere og elektroporation for genetiske transformation.
2-trins fusion PCR kræver genomisk DNA, antibiotikaresistens-markørgen som PCR skabelon og fire par korrekt designet oligonukleotid primere. I det første trin (1st PCR), en 1-kb opstrøms flankerende region af target-genet, en 1-kb downstream flankerende region af målet forstærkes-genet, og antibiotika-resistens markørgen ved PCR. 5' regionerne i både de omvendte primer og den fremad primer, til forstærkning af upstream og downstream omfatter flankerende regioner, henholdsvis, 15 baser supplement til enderne af markørgen. 5' regionerne i både forward og reverse primere for markør gen amplifikation ligeledes omfatte 15 baser supplement til den nederste ende af upstream flankerende regionen af target-genet og den øverste ende af den downstream flankerende region af genet mål henholdsvis. Derfor, de tre forstærket fragmenter indeholder overlappende 30-basepar områder på webstedet fusion. I det andet trin (2nd PCR) udføres PCR med indlejrede PCR primere ved hjælp af de tre fragmenter forstærkes af de 1st PCR som skabeloner. De supplerende regioner af skabelonerne er desuden forbundet med hinanden via den 2nd PCR. Endelig, konstruere for homologe rekombination er introduceret til vildtype stamme af elektroporation. Vellykket gen forstyrrelser kan bekræftes ved PCR ved hjælp af specifikke primere. Selv om afbrydelse konstruktionen forstærkes ved hjælp af high-fidelity DNA polymerase, er yderligere enzymatiske reaktioner, såsom DNA ligatur eller DNA fordøjelsen, ikke nødvendige for at generere konstruktionen. Derudover kan en slettede eller konserverede region på genomet vælges fleksibelt efter primer design.
I den nuværende arbejde, blev sletning af den hele kodende region af gtfC -genet, som koder glucosyltransferase i Streptococcus mutans, udført for at påvise hurtig og nem gen forstyrrelser metode i en streptokok arter. Derudover en gtfB-forstyrret stamme blev genereret på samme måde. Glucosyltransferases kodet af både gtfC og gtfB bidrage til kariogene dental biofilm udvikling5,6. Wild-type biofilm-dannende evner stamme (S. mutans WT), gtfC-forstyrret stamme (S. mutans ΔgtfC) og gtfB-forstyrret stamme (S. mutans ΔgtfB) blev evalueret for sammenlignende fænotypiske analyser. Denne protokol udvider anvendelsen af en to-trins metode til gen afbrydelse af en yderligere arter og kan ændres til undersøgelser af genfunktioner i en bredere vifte af taxa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>Wild-type strain (Strain UA159)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating disruption apparatus</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>GM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic genes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Astec</td>
			<td>PC-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>35 bases in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2-cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>057-07151</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

Typiske metoder til udredning af funktionen af et bestemt gen indebærer sammenlignende fænotypiske analyser af wild-type belastning og en stamme, hvor gen af interesse har været forstyrret. En gen-forstyrrelser DNA konstruktion der indeholder en egnet antibiotikaresistens-markørgen er nyttige for generation af gen-forstyrret stammer i bakterier. Men konventionelle byggemetoder, der kræver gen kloning trin, involverer komplekse og tidskrævende protokoller. Her, er en relativt letkøbt, hurtig og omkostningseffektiv metode til målrettede gen forstyrrelser i Streptococcus mutans beskrevet. Metoden udnytter en 2-trins fusion Polymerasekædereaktionen (PCR) til at generere forstyrrelser konstruktion og elektroporation for genetiske transformation. Denne metode kræver ikke en enzymatisk reaktion, end PCR, og giver desuden større fleksibilitet med hensyn til udformningen af forstyrrelser konstruktion. Beskæftigelse af elektroporation letter udarbejdelsen af kompetente celler og forbedrer transformation effektivitet. Den nuværende metode kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter.

Figur 2 viser, at størrelsen af hvert produkt fra den 1st PCR, som observeres på 1%-agarosegel, var i god aftale med den forventede størrelse af ca. 1 kb. Figur 3 viser den gel elektroforese analyse af produkter fra de 2nd PCR. Figur 4 viser S. mutans kolonier omdannet med forstyrrelser konstruktion, og en gel elektroforese analyse af kolonien PCR produkter. Amplikon...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Vi beskriver en letkøbt, hurtig og relativt billig metode for generation af gen-forstyrret Streptococcus mutans stammer; denne teknik kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter.

Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Dannelse af fluorescerende protein-fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Forberedelse af prøver og analyser af RNASeq-baseret genekspression Data fra zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion og identifikation af CRISPR/Cas9-genereret gen Knockouts i Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning for pattedyr systemer

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forstærkning af nær fuld længde HIV-1 provirus for næste Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

En tilpasselig protokol for streng forsamling gRNA kloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation af genfunktioner i mexicansk Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...