Name: generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la société japonaise pour la Promotion de la Science [Grant Numbers 16 K 15860 à T.M. et 15 K 15777 à N.H.].

1. conception d’amorce <ol><li>préparer des amorces pour 2-step fusion PCR et la vérification d’une perturbation gène. 
	Remarque : Le tableau 1 indique les séquences d’amorces utilisées dans le présent protocole. la figure 1 montre une illustration schématique de la méthode PCR de 2 étapes de fusion utilisée pour générer de S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>Des amorces de conception pour le remplacement de la région ...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors.">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).</li><li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II.">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li><li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis.">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis.">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li></ol>

Dans le présent protocole, les amorces pour le 1st PCR doivent être conçus pour amplifier environ 1 Ko en amont et en aval des régions flanquantes de la région cible dans le génome. De telles séquences flanquantes longtemps sont nécessaires pour améliorer l’efficacité de la recombinaison homologue.
Les séquences des amorces (haut-inverse, vers le bas en avant, spc,r-avance et spcr-inverse) dans le présent protocole ont été dét...

Analyse de la fonction génique implique généralement une comparaison phénotypique entre une souche sauvage et une déformation dans laquelle un gène d’intérêt a été perturbé. Cette technique de gène-perturbation a été utilisée pour les analyses de la fonction du gène dans un large ensemble de taxons, des bactéries aux mammifères. Une construction de gène-perturbation est nécessaire pour la génération de la souche de gène-perturbé ; Cette construction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) comprend le gène marqueur de résistance aux antibiotiques fusionné à l’amont et l’aval des régions flanquantes du gène ciblé et est incorporée dans le génome par recombinaison homologue. La souche perturbé de gène peut être isolée en utilisant des milieux sélectifs contenant l’antibiotique. La méthode classique utilisée pour la construction de la souche de gène-perturbée nécessite des étapes complexes, telles que l’amplification du gène cible par polymerase chain reaction (PCR), ligature du gène dans un plasmide approprié, digestion avec restriction enzymes et RELIGACIÓN pour insérer le gène marqueur de résistance aux antibiotiques. Ce processus prend du temps, prenant plusieurs jours à plusieurs semaines, selon le succès de chaque étape. En outre, la conception de constructions de perturbation repose sur les sites de l’enzyme de restriction du gène cible. Pour résoudre ces problèmes, basées sur la PCR ADN épissage méthodes1,2 pour la conception de gène-perturbé des mutants de Dictyostelium discoideum3 et Synechocystis SP. PCC68034 ont été rapportés. Dans la présente étude, il a développé une méthode pour générer une souche de streptocoque gène-perturbé de façon relativement rapide, facile et peu coûteuse, en utilisant une méthode de PCR-based modifiée (désignée 2-step fusion PCR) pour la construction de la perturbation construction et électroporation pour transformation génétique.
La fusion de 2 étapes que PCR nécessite quatre paires d’ADN génomique et le gène marqueur de résistance aux antibiotiques comme modèle PCR convenablement conçu des amorces oligonucléotidiques. Dans la première étape (1st PCR), une région de flanquement 1 kb en amont du gène cible, une région de flanquement 1 kb en aval de la cible génétique et le gène marqueur de résistance aux antibiotiques sont amplifiés par PCR. Les régions 5' de l’apprêt inversée et l’amorce vers l’avant, pour l’amplification de l’amont et en aval les régions flanquantes, respectivement, incluent 15 bases complémentaires jusqu’aux extrémités du gène marqueur. Les régions 5' d’amorces avant et arrière pour l’amplification du gène marqueur de même incluent 15 bases complémentaires à l’extrémité inférieure de la région d’accompagnement en amont du gène cible et l’extrémité supérieure de la région de flanquement en aval du gène cible, respectivement. Par conséquent, les trois fragments amplifiés contiennent des régions de 30-nucléotide qui se chevauchent sur le site de fusion. Dans la deuxième étape (2nd PCR), PCR est réalisée avec des amorces PCR imbriqués à l’aide de trois fragments amplifiés par le 1st PCR en tant que modèles. Les régions complémentaires des modèles sont en outre reliées entre eux par l’intermédiaire de la 2ème PCR. Enfin, la construction de la recombinaison homologue est introduite à la souche sauvage par électroporation. Perturbation du gène réussie peut être vérifiée par PCR avec des amorces spécifiques. Bien que la construction de la perturbation est amplifiée utilisant haute fidélité ADN polymérase, les réactions enzymatiques supplémentaires, tels que la ligature d’ADN ou de la digestion de l’ADN, ne sont pas nécessaires pour générer la construction. En outre, une région supprimée ou conservée sur le génome peut être avec souplesse choisie selon la conception d’amorce.
Dans le présent travail, suppression de toute la région codante du gène gtfC , qui encode glucosyltransférase chez Streptococcus mutans, a été réalisée pour illustrer la méthode de perturbation rapide et facile des gènes dans une espèce de streptocoque. En outre, un gtfB-souche perturbée provenait de la même manière. La glycosyltransférase codé par gtfC et gtfB contribue à cariogènes biofilm dentaire développement5,6. Les capacités de formation de biofilm de la souche sauvage de la souche (S. mutans WT), gtfC-perturbé la souche (S. mutans ΔgtfC) et gtfB-souche perturbée (S. mutans ΔgtfB) ont été évalués pour les analyses phénotypiques comparatives. Ce protocole étend l’application d’une méthode en deux étapes pour la rupture du gène d’autres espèces et peut-être être modifié pour l’étude de la fonction des gènes dans un plus grand nombre de taxons.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>Wild-type strain (Strain UA159)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating disruption apparatus</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>GM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic genes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Astec</td>
			<td>PC-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>35 bases in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2-cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>057-07151</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

Méthodes typiques pour l’élucidation de la fonction d’un gène particulier comportent des analyses comparatives et phénotypiques de la souche sauvage et une souche dont le gène d’intérêt a été perturbé. Une construction d’ADN gène-perturbation contenant un gène marqueur de résistance aux antibiotiques appropriés est utile pour la génération des souches perturbé de gène dans les bactéries. Cependant, les méthodes de construction classiques, qui nécessitent des mesures clonage de gènes, axée sur des protocoles complexes et fastidieuses. Ici, une méthode relativement facile, rapide et rentable pour la rupture du gène ciblé chez Streptococcus mutans est décrite. La méthode utilise une fusion 2-étape chaîne par polymérase (PCR) pour générer la perturbation construct et électroporation pour transformation génétique. Cette méthode ne nécessite pas une réaction enzymatique, autres que les PCR et offre en outre une plus grande flexibilité en ce qui concerne la conception de la construction de la perturbation. Emploi d’électroporation facilite la préparation des cellules compétentes et améliore l’efficacité de la transformation. La présente méthode peut être adaptée pour la production de souches de gène-perturbée de diverses espèces.

La figure 2 montre que la taille de chaque produit du 1st PCR, tel qu’observé sur le gel d’agarose à 1 %, est en bon accord avec la taille estimée d’environ 1 kb. La figure 3 montre l’analyse par électrophorèse sur gel des produits de la 2ème PCR. La figure 4 montre des colonies de S. mutans transformés avec la construction de la perturbation et une analy...

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Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Nous décrivons une méthode facile, rapide et relativement peu coûteuse pour la génération de gène-perturbé Streptococcus mutans souches ; Cette technique peut être adaptée pour la production de souches de gène-perturbée de diverses espèces.

Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage

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