Name: generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי החברה יפן הקידום של המדע [מספרים גרנט 16 K 15860 אל ט. מ ו- 15 K 15777 כדי N.H.].

1. פריימר עיצוב <ol><li>להתכונן תחל 2-שלב פיוז ' ן PCR ואימות של שיבוש גנטי. 
	הערה: טבלה 1 מציגה את רצפי פריימר בשימוש בפרוטוקול זה. איור 1 מראה של איור סכמטי של שיטת ה-PCR 2-שלב פיוז ' ן המשמש ליצירת Δ ס mutans gtfC.
	<ol><li>תחל עיצוב עבור התחליף של אזור היעד הגנו?...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors.">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).</li><li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II.">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li><li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis.">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis.">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li></ol>

בפרוטוקול הנוכחי, יש לתכנן את צבעי יסוד 1סנט PCR כדי להגביר כ 1 kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של אזור היעד הגנום. רצפי זמן איגוף כאלה נחוצים לשפר את היעילות של רקומבינציה הומולוגית.
מסדרות תחל (היפוך למעלה, למטה-קדימה, spcr-קדימה, ו- spcr-הפוך) בפרוט...

הפונקציה מפענוח כוללת בדרך כלל השוואה פנוטיפי בין זן פראי-סוג זן שבו גן מסוים של עניין יש נשענה. טכניקה זו ג'ין-הפרעה יש נעזרו ג'ין ניתוחים פונקציה במגוון רחב של taxa, מחיידקים יונקים. מבנה הגן-הפרעה הוא הכרחי עבור הדור של המתח שיבשו-גן; המבנה הזה, חומצה deoxyribonucleic (DNA) מורכב הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה דבוקה את ויוצאת איגוף מחוזות הגן היעד, הוא שולב הגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית. המתח שיבשו גנים עשויים להיות מבודדים באמצעות המדיה סלקטיבי המכילה האנטיביוטיקה. השיטה המקובלת המשמש לבנייה של המתח שיבשו ג'ין דורש צעדים מורכבים, כגון ההגברה של הגן היעד על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מצדו של הגן לתוך פלסמיד מתאים, מערכת העיכול עם הגבלה אנזימים, religation להוסיף את הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה. תהליך זה הוא זמן רב, לוקח מספר ימים עד מספר שבועות, בהתאם להצלחת כל שלב. בנוסף, העיצוב של הפרעה בונה תלויה האתרים אנזים הגבלה של הגן היעד. כדי לפתור בעיות אלה, דווחו DNA מבוססי ה-PCR splicing שיטות1,2 על עיצוב האתר של ג'ין שיבשו מוטציות של Dictyostelium discoideum3 ו- Synechocystis sp. PCC68034 . במחקר הנוכחי, פותחה שיטה ליצור זן streptococcal משובשות ג'ין בצורה מהירה יחסית, נתיישב, וזולה, ניצול שיטה מבוססת-PCR ששונתה (איזור 2-שלב פיוז ' ן PCR) לבנייה של ההפרעה לבנות, אלקטרופורציה לשינוי גנטי.
היתוך גרעיני 2-שלב שה-PCR דורש דנ א גנומי, הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה כתבנית PCR ו- 4 זוגות כראוי מעוצב לנוקלאוטידים. בשלב הראשון (1סנט PCR), אזור במעלה 1-kb איגוף של הגן היעד, אזור במורד הזרם 1-kb איגוף של היעד ג'ין, הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה הם מוגבר על ידי ה-PCR. 5' אזורים ומהצמיגים הפוכה והן את קדימה למתחילים, הגברה של במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים, בהתאמה, כוללים משלים הקצוות של הגן סמן 15 בסיסים. 5' אזורים ויוצאים צבעי יסוד סמן גנטי הגברה באופן דומה לכלול 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזור איגוף במעלה הזרם של הגן היעד, בקצה העליון של האזור איגוף במורד הזרם של הגן היעד, בהתאמה. לכן, שברי מוגבר שלושה מכילים אזורים חופפים זוג 30-בסיסים באתר פיוז'ן. בשלב השני (2nd PCR), PCR מבוצע עם תחל PCR מקוננות באמצעות שלושה שברי מוגבר על ידי 1סנט PCR כתבניות. האזורים משלימים תבניות בנוסף מקושרים אחד לשני באמצעות 2nd PCR. לבסוף, הבונה על רקומבינציה הומולוגית הוא הכיר את המתח פראי-סוג מאת אלקטרופורציה. ניתן לבירור שיבוש גנטי מוצלחת על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים. למרות הבונה הפרעה מוגבר באמצעות אמינות גבוהה DNA פולימראז, תגובות אנזימטיות נוספים, כגון ה-DNA מצדו או עיכול דנ א, אינם הכרחיים ליצירת הבונה. בנוסף, אזור שנמחקו או משומר על הגנום יכול לבחור בגמישות על פי עיצוב פריימר.
בשנת העבודה הנוכחית, בוצעה מחיקה של כל האזור קידוד של הגן gtfC , שמקודד glucosyltransferase ב mutans סטרפטוקוקוס, כדי להדגים את שיטת שיבוש גנטי מהיר, קל זן streptococcal. בנוסף, gtfB-זן שיבשו נוצר באופן זהה. Glucosyltransferases מקודד על ידי הן gtfC והן gtfB לתרום cariogenic שיניים biofilm פיתוח5,6. היכולות להיוות biofilm הפראי-סוג זן (ס' mutans WT), gtfC-הפרעת המתח (Δס mutans gtfC), gtfB-זן שיבשו (Δס mutans gtfB) הוערכו עבור ניתוחים פנוטיפי השוואתי. פרוטוקול זה מרחיב את היישום של שיטה שני שלבים של הפרעה גן זן נוסף, עשוי להיות שונה עבור מחקרים של ג'ין פונקציה במגוון רחב יותר של taxa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>Wild-type strain (Strain UA159)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating disruption apparatus</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>GM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic genes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Astec</td>
			<td>PC-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>35 bases in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2-cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>057-07151</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

שיטות טיפוסי הבהרה של הפונקציה של גן מסוים כרוך ניתוח השוואתי פנוטיפי של המתח פראי-סוג של זן אשר שיבשו את הגן עניין. מבנה ה-DNA ג'ין-הפרעה המכיל גן מרקר מתאים עמידות לאנטיביוטיקה היא שימושית לדור של ג'ין-שיבשו זנים של חיידקים. עם זאת, שיטות בנייה קונבנציונלית, אשר דורשים צעדים שיבוט גנטי, כרוכים פרוטוקולים מורכב ולגזול. כאן, מתוארת שיטה יחסית נתיישב, מהירה וחסכונית עבור ג'ין יישוב להפרעה mutans סטרפטוקוקוס . השיטה משתמשת 2-שלב פיוז ' ן תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כדי ליצור את השיבוש לבנות ואת אלקטרופורציה לשינוי גנטי. שיטה זו אינה דורשת לתגובה אנזימטיות, מלבד PCR, ומציע בנוסף גמישות רבה יותר מבחינת העיצוב של הבונה שיבוש. העסקתם של אלקטרופורציה מקלה על ההכנה של תאים המוסמכת ומשפר את היעילות טרנספורמציה. השיטה הנוכחי עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

איור 2 מציג את הגודל של כל מוצר מ- 1סנט PCR, כפי שנצפה על הג'ל 1% agarose, היה הסכם טוב עם חזה בגודל של 1 kb. איור 3 מראה ג'ל אלקטרופורזה ניתוח של המוצרים של 2nd PCR. איור 4 מראה המושבות ס mutans טרנספורמציה עם הבונה שיבושים, נית...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

הדור של Fusions חלבון פלורסנט<em&gt; קנדידה</em&gt; מינים

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

פרוטוקול ניתן להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...