Name: generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia [números de concesión 16 K 15860 T.M. y 15 K 15777 N.H.].

1. primer diseño <ol><li>preparar iniciadores para polimerización en cadena de la fusión de 2 pasos y verificación de la interrupción del gene. 
	Nota: La tabla 1 muestra las secuencias de la cartilla utilizadas en el presente Protocolo. la figura 1 muestra una ilustración esquemática del método PCR de fusión de 2 pasos para generar Δ de S. mutans gtfC.
	<ol><li>Cartillas de diseño para el reemplazo de la región de dest...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors.">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).</li><li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II.">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li><li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis.">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis.">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li></ol>

En el presente Protocolo, deberán diseñarse los iniciadores 1st PCR para amplificar 1 kb aproximadamente aguas arriba y aguas abajo flanqueando las regiones de la región de destino en el genoma. Tales secuencias largas que flanquean son necesarios para mejorar la eficacia de la recombinación homóloga.
Las secuencias de los cebadores (arriba-atrás, abajo-adelante, spcr-adelante y spcr-reversa) en el presente Protocolo se determina automá...

Análisis de la función génica implica típicamente una comparación fenotípica entre una cepa de tipo salvaje y una cepa en la que un determinado gen de interés se ha visto alterado. Esta técnica de interrupción génica se ha utilizado para el análisis de la función del gene en una amplia gama de especies, desde bacterias hasta mamíferos. Un constructo gene-interrupción es necesario para la generación de la cepa gen interrumpido; Esta construcción de ácido desoxirribonucleico (ADN) consiste en el gen marcador de resistencia a los antibióticos sobre el upstream y downstream flanqueando las regiones del gen blanco y se incorpora en el genoma por recombinación homóloga. La cepa gen interrumpido puede ser aislada usando medios selectivos que contienen el antibiótico. El método convencional utilizado para la construcción de la cepa gen interrumpido requiere medidas complejas, como la amplificación del gen por reacción en cadena de polimerasa (PCR), la ligadura del gen en un plásmido adecuado, digestión con restricción de destino enzimas y religación para insertar el gen marcador de resistencia a antibióticos. Este proceso es lento, tomando varios días a varias semanas, dependiendo el éxito de cada paso. Además, el diseño de construcciones de la interrupción depende de los sitios de la enzima de la restricción del gene blanco. Para resolver estos problemas, se han reportado DNA Polimerización en cadena-basado que empalma métodos1,2 para el diseño de mutantes gene-disrupted de Dictyostelium discoideum3 y Synechocystis SP. PCC68034 . En el presente estudio, se desarrolló un método para generar una cepa estreptocócica gen interrumpido de una manera relativamente rápida, fácil y de bajo costo, utilizando un método modificado basado en PCR (señalado paso 2 fusión PCR) para la construcción de la interrupción construcción y electroporación para transformación genética.
La fusión de 2-step que PCR requiere de ADN genómico, el gen marcador de resistencia a los antibióticos como una plantilla PCR y cuatro pares de apropiadamente diseñado cartillas del oligonucleótido. En el primer paso (1st de PCR), una región que flanqueaba aguas arriba de 1 kb del gene del destino, una región que flanqueaba aguas abajo de 1 kb del objetivo gen y el gen marcador de resistencia a antibióticos se amplifican por PCR. Las regiones 5' de la cartilla reversa y la cartilla hacia adelante, para la amplificación de la aguas arriba y aguas abajo que flanquean regiones, respectivamente, incluyen 15 bases complementarios a los extremos del gen marcador. Las 5' regiones de avance y retroceso primers para la amplificación del gen marcador igualmente incluyen 15 bases complementarias a la parte inferior de la región que flanqueaba por aguas arriba de la gene de la blanco y el extremo superior de la región que flanqueaba corriente abajo del gen blanco, respectivamente. Por lo tanto, los tres fragmentos amplificados contienen regiones de 30-pares superpuestos en el sitio de fusión. En el segundo paso (2nd PCR), PCR se realiza con las cartillas PCR anidadas utilizando los tres fragmentos amplificados por la 1st PCR como plantillas. Las regiones complementarias de las plantillas están además vinculadas entre sí a través de la 2nd PCR. Por último, la construcción para la recombinación homóloga es introducida a la cepa de tipo salvaje por electroporación. Interrupción génica exitosa puede ser verificada por PCR usando las cartillas específicas. Aunque el concepto de interrupción se amplifica utilizando la DNA polimerasa de alta fidelidad, reacciones enzimáticas adicionales, tales como la ligadura de la DNA o digestión de DNA, no son necesarias para generar la construcción. Además, una región eliminada o conservada en el genoma puede ser elegida fexiblemente según primer diseño.
En el presente trabajo, canceladura de la región entera de la codificación del gene gtfC , que codifica la glucosiltransferasa de Streptococcus mutans, se realizó para demostrar el método de interrupción del gene rápido, fácil en una especie estreptocócica. Además, un gtfB-alteración de la tensión se generó de la misma manera. Glucosiltransferasas codificados por gtfB y gtfC contribuyen a cariogénicas biofilm dental desarrollo5,6. Las capacidades de formación de biofilm del tipo tensión (S. mutans WT), gtfC-interrumpió cepa (S. mutans ΔgtfC) y gtfB-tensión interrumpida (S. mutans ΔgtfB) se evaluaron análisis fenotípico comparativo. Este protocolo extiende la aplicación de un método de dos etapas para la interrupción del gene de una especie adicional y puede ser modificado para los estudios de función del gen en una amplia gama de taxa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>Wild-type strain (Strain UA159)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating disruption apparatus</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>GM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic genes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Astec</td>
			<td>PC-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>35 bases in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2-cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>057-07151</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

Métodos típicos para la aclaración de la función de un gen en particular implican Analisis comparativo fenotípicas de la cepa de tipo salvaje y una cepa en la que el gen de interés se ha visto alterado. Una construcción de DNA gen-interrupción que contiene un gen marcador de resistencia antibiótica adecuada es útil para la generación de cepas alterado por la gen en la bacteria. Sin embargo, métodos de construcción convencionales, que requieren medidas clonaje de genes, implican protocolos complejo y desperdiciador de tiempo. Aquí, se describe un método relativamente fácil, rápido y rentable para la interrupción de genes específicos en Streptococcus mutans . El método utiliza una fusión de paso 2 reacción en cadena polimerasa (PCR) para generar el concepto de interrupción y electroporación para transformación genética. Este método no requiere de una reacción enzimática, que no sea de la polimerización en cadena y además ofrece una mayor flexibilidad en cuanto al diseño de la construcción de la interrupción. Empleo de la electroporación facilita la preparación de células competentes y mejora la eficiencia de transformación. El presente método puede adaptarse para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.

La figura 2 muestra el tamaño de cada producto desde la 1st PCR, como se observa en el gel de agarosa al 1%, fue en buen acuerdo con el tamaño previsto de aproximadamente 1 kb. La figura 3 muestra el análisis de electroforesis de gel de los productos de la 2y PCR. La figura 4 muestra las colonias de S. mutans transformadas con la construcción de la interrupción y u...

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Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Se describe un método fácil, rápido y relativamente barato para la generación de gene-disrupted Streptococcus mutans cepas; Esta técnica puede ser adaptada para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.

Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Research

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Genetics

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

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