Name: generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

Detta arbete stöds av Japan Society för främjande av vetenskap [Grant nummer 16 K 15860 till T.M. och 15 K 15777 till N.H.].

1. primer Design <ol><li>förbereda primers för 2-stegs fusion PCR och verifiering av genen störningar. 
	Obs: Tabell 1 visar de primer sekvenser används i detta protokoll. figur 1 visar en Schematisk illustration av 2-stegs fusion PCR-metoden används för att generera S. mutans Δ gtfC.
	<ol><li>Design primers för ersättning av målregionen i genomet med Spektinomycin-motstånd genen (spc r) <sup class="x...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors.">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).</li><li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II.">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li><li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis.">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis.">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li></ol>

I detta protokoll, måste primers för 1st PCR utformas för att förstärka ungefär 1 kb uppströms och nedströms angränsande regioner i målregionen i genomet. Sådana länge flankera sekvenser är nödvändigt att förbättra effektiviteten i homolog rekombination.
Sekvenserna av primers (uppåt-bakåt, nedåt-framåt, spcr-framåt, och spcr-omvänd) i detta protokoll var bestäms automatiskt baserat på platsen för införlivandet av de...

Gen funktion analys innebär vanligtvis en fenotypisk jämförelse mellan en vildtyp stam och en stam där en särskild gen av intresse har störts. Denna gen-störningar teknik har använts för gen funktion analyser i ett brett utbud av taxa, från bakterier till däggdjur. En gen-störningar konstruktion krävs för generering av den gen-stört stammen; Denna deoxiribonukleinsyra (DNA) konstruktion består av den markörgen för antibiotikaresistens som smält till uppströms och nedströms angränsande regioner av målgenen och införlivas i genomet via homolog rekombination. Gen-stört stammen kan isoleras med selektiva medier som innehåller antibiotika. Den konventionella metoden som används för konstruktion av gen-stört stammen kräver komplexa steg, till exempel förstärkning av målgenen av polymeraskedjereaktion (PCR), ligatur av genen in i en lämplig plasmid, matsmältningen med begränsning enzymer och religation att infoga antibiotika-resistens markörgen. Denna process är tidskrävande, tar flera dagar till flera veckor, beroende på framgången för varje steg. Utformningen av störningar konstruktioner är dessutom beroende av restriktionsenzym webbplatser av målgenen. Lös dessa problem genom har PCR-baserade DNA skarvning metoder1,2 för design av gen-stört mutanter av Dictyostelium discoideum3 och Synechocystis sp. PCC68034 rapporterats. I den aktuella studien utvecklades en metod för att generera en gen-stört streptokocker stam i en relativt snabb, lättköpt och billigt sätt, använda en modifierad PCR-baserade metod (designerat 2-steg fusion PCR) för byggande av störningar konstruera och elektroporation för genetisk transformation.
2-stegs fusion PCR kräver genomiskt DNA, markörgen för antibiotikaresistens som PCR-mall och fyra par lämpligt utformad oligonukleotiden primers. I det första steget (1st PCR), en 1-kb uppströms flankera region av målgenen, en 1-kb nedströms flankera region i målet förökas, och genen de antibiotika-resistens markör med PCR. 5' regionerna både reverse primer och den framtida primern, för förstärkning av uppströms och nedströms inkluderar angränsande regioner, respektive 15 baser komplement till ändarna av genen markör. 5' regionerna av både framåt och bakåt primers för markör gen förstärkning på samma sätt inkluderar 15 baser kompletterar den nedre änden av målgenen uppströms flankera regionen och den övre änden av målgenen, nedströms flankera regionen respektive. Därför innehålla tre förstärkta fragment överlappande 30-baspar regioner på webbplatsen fusion. I det andra steget (2nd PCR) utförs PCR med nästlade PCR primers använder tre fragmenten förstärks av 1st PCR som mallar. De kompletterande regionerna av mallarna är dessutom kopplade till varandra via 2nd PCR. Slutligen introduceras konstruktionen för homolog rekombination till vildtyp stam av elektroporation. Framgångsrik gen störningar kan verifieras genom PCR använder specifika primers. Även om den störningar konstruktionen är förstärkt med HiFi-DNA-polymeras, behövs inte ytterligare enzymatiska reaktioner, såsom DNA-ligering eller DNA matsmältningen, att generera konstruktionen. Dessutom kan en borttagna eller konserverade region på genomet väljas flexibelt enligt primer design.
I den nuvarande arbetet utfördes radering av hela kodande regionen av gtfC -genen, som kodar glukosyltransferas i Streptococcus mutans, för att demonstrera metoden snabb, enkel gen störningar i släktet streptokocker. Dessutom en gtfB-störd stam genererades på samma sätt. De glucosyltransferases som kodas av både gtfC och gtfB bidra till cariogenic dental biofilm utveckling5,6. Biofilm-bilda kapaciteterna av vildtyp stam (S. mutans WT), gtfC-stört stam (S. mutans ΔgtfC) och gtfB-störd stam (S. mutans ΔgtfB) utvärderades för jämförande fenotypiska analyser. Detta protokoll utsträcks tillämpningen av en två-stegs metod för genen avbrott en ytterligare arter och kan ändras för studier av geners funktion i ett bredare utbud av taxa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>Wild-type strain (Strain UA159)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating disruption apparatus</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>GM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic genes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Astec</td>
			<td>PC-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>35 bases in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2-cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>057-07151</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

Typiska metoder för förtydligandet av funktionen av en särskild gen innebär jämförande fenotypiska analyser av vildtyps-stammen och en stam där genen av intresse har störts. En gen-störningar DNA konstruktion som innehåller en lämplig markör antibiotikaresistensgen är användbart för generering av gen-stört stammar i bakterier. Dock innebära konventionella byggmetoder, som kräver gen kloning steg, komplexa och tidskrävande protokoll. Här beskrivs en relativt lättköpt, snabb och kostnadseffektiv metod för riktade gene störningar i Streptococcus mutans . Metoden utnyttjar en 2-stegs fusion polymeras-kedjereaktion (PCR) för att generera störningar konstruera och elektroporation för genetisk transformation. Denna metod kräver inte en enzymatisk reaktion, än PCR, och erbjuder dessutom större flexibilitet när det gäller utformningen av den störningar konstruktion. Anställning av elektroporation underlättar utarbetandet av behöriga celler och förbättrar omvandling effektiviteten. Denna metod kan anpassas för generering av gen-stört stammar av olika arter.

Figur 2 visar att storleken på varje produkt från 1st PCR, som observerats på 1% agarosgel, var bra överens med den förväntade storleken av ungefär 1 kb. Figur 3 visar gelelektrofores analysen av produkterna av 2nd PCR. Figur 4 visar S. mutans kolonier omvandlas med den störning konstruktionen och en gelelektrofores analys av kolonin PCR-produkter. Amplikoner fr...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Vi beskriver en lättköpt, snabba och relativt billig metod för generering av gen-stört Streptococcus mutans stammar; Denna teknik kan anpassas för generering av gen-stört stammar av olika arter.

Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generering av fluorescerande protein Fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Provberedning och analys av RNASeq-baserade gen uttryck Data från zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion och identifiering av CRISPR/Cas9-genererade gen Knockouts i det modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning av däggdjur system

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Förstärkning av nära fullängds HIV-1 Proviruses för nästa generations sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

En anpassningsbar protokoll för sträng församlingen gärna kloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation av geners funktion i mexikanska släktet

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...