Name: generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning
Uploaded: 2017-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

Bu eser bilim promosyon [Grant sayıları 16 K 15860-m. ve 15 K 15777 N.H. için] Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir.

1. Astar tasarım <ol><li>2-adım fusion PCR ve gene bozulma doğrulanması için astar hazırlayın. 
	Not: Tablo 1 bu protokol için kullanılan astar dizileri gösterir. şekil 1 bir şematik S. mutans çoğunlukla Δ gtfC oluşturmak için kullanılan 2-adım füzyon PCR yöntemi gösterir.
	<ol><li>Tasarım astar genom Spektinomisin-direnç gen (spc r) 7 ile hedef bölgede değişti...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li><li>Kuwayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+generation+of+a+gene+disruption+construct+without+the+use+of+DNA+ligase+and+plasmid+vectors.">PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors.</a> Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).</li><li>Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digalactosyldiacylglycerol+is+required+for+stabilization+of+the+oxygen-evolving+complex+in+photosystem+II.">Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II.</a> Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).</li><li>Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+Streptococcus+mutans+glucosyltransferase+gene+coding+for+insoluble+glucan+synthesis.">Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis.</a> Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).</li><li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutans+gtfC+gene,+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans.">Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li><li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD(9)+determinant+from+Enterococcus+faecalis.">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li><li>Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cloning+vector+able+to+replicate+in+Escherichia+coli+and+Streptococcus+sanguis.">A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis.</a> Gene. 19 (3), 345-353 (1982).</li><li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans.">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).</li><li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans.">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).</li><li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci:+application+and+efficiency.">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li><li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR.">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li></ol>

Mevcut protokolünde astar 1st PCR için yaklaşık 1 kb upstream ve downstream genom hedef bölgede bölgelerinde kanat yükseltmek için tasarlanmış olmalıdır. Homolog rekombinasyon verimliliğini artırmak gerekli uzun kanat böyle dizileridir.
Astar dizisi (up-geri, aşağı-ileri, spcr-ileri ve spcr-ters) Bu protokol için otomatik olarak bozulma yapı birleşme ücreti göre belirlenmiştir. Her astar 15 üsleri tamamlayıcı 2n...

Gene işlev analiz genellikle bir vahşi tipi yük ve ilgi belirli bir gen getirilmiş bir yük arasında fenotipik bir karşılaştırma içerir. Bu gen-bozulma teknik gen işlevi analizleri takson, memeliler için bakterilerden geniş bir alanda kullanılmıştır. Gen alt üst baskı üretimi için gerekli bir gen-bozulma yapıdır; Bu deoksiribonükleik asit (DNA) yapı akış yukarı ve aşağı akım hedef gen bölgelerinde kanat erimiş antibiyotik direnci marker gen oluşur ve homolog rekombinasyon ile genom içine dahil edilmiştir. Gen kesintiye zorlanma antibiyotik içeren seçmeli medya kullanarak izole olabilir. Gen kesintiye zorlanma yapımı için kullanılan geleneksel yöntem Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), gen ligasyonu içine uygun bir plazmid, hazım ile sınırlama tarafından hedef gen amplifikasyon gibi karmaşık adımlar gerektirir enzimler ve antibiyotik direnç marker gen eklemek için religation. Her adım başarısını bağlı olarak birkaç hafta için birkaç gün alarak zaman alıcı bir süreçtir. Buna ek olarak, tasarım kesintileri yapıları, hedef gen restriksiyon enzimi sitelerinde bağlıdır. Bu sorunları gidermek için DNA PCR tabanlı yapıştırma yöntemleri1,2 tasarım Dictyostelium discoideum3 ve Synechocystis sp. PCC68034 mutant gen bozulduğu için bildirilmiştir. Bu da çalışmanın, kesintiye uğraması yapımı için (2-adım füzyon PCR belirlenmiş) değiştirilmiş bir PCR tabanlı yöntemi kullanan bir nispeten hızlı, facile ve ucuz şekilde bir gen kesintiye streptokok yük oluşturmak için bir yöntem geliştirildi yapý ve elektroporasyon genetik dönüşüm.
PCR genomik DNA, antibiyotik direnci marker gen PCR şablon olarak ve dört çift uygun şekilde gerektirir 2-adım füzyon Oligonükleotid astar tasarlanmış. İlk adım (1st PCR), hedef gen, hedef 1-kb aşağı akım kanat bölge 1-kb ters yönde kanat bölge gen ve antibiyotik direnç marker gen PCR ile güçlendirilmiş. 5' bölgeleri ters astar ve amplifikasyon upstream ve downstream için ileri astar bölgeler, sırasıyla, kanat 15 üsleri marker gen sonuna kadar tamamlayıcı içerir. İleriye ve geriye doğru astar marker gen amplifikasyon için 5' bölgeleri aynı şekilde 15 üsleri hedef gen ters yönde kanat bölgesinin alt sonuna ve akış aşağı kanat hedef gen bölgesinin üst sonu için tamamlayıcı dahil, anılan sıraya göre. Bu nedenle, üç güçlendirilmiş parçaları üst üste gelen 30-baz çifti bölgesini fusion sitesinde içerir. İkinci adımda (2nd PCR), PCR 1st PCR Şablonlar olarak tarafından güçlendirilmiş üç parçaları kullanarak iç içe geçmiş PCR astar ile gerçekleştirilir. Şablonlar tamamlayıcı bölgelerinde Ayrıca 2nd PCR birbirine bağlıdır. Son olarak, yapı homolog rekombinasyon için vahşi tipi zorlanma için elektroporasyon tarafından tanıtıldı. Başarılı gene bozulma belirli primerler kullanılarak PCR tarafından doğrulanmadı. Yüksek sadakat DNA polimeraz kullanarak bozulma yapısı güçlendirilmiş, DNA ligasyonu veya DNA sindirim, gibi ek enzimatik reaksiyonları yapı oluşturmak gerekli değildir. Buna ek olarak, genom bir silinmiş veya korunmuş bölge esnek astar tasarım göre seçmiş olabilirsiniz.
Mevcut çalışma, Streptococcus mutans çoğunluklaglucosyltransferase kodlar, gtfC gen tüm kodlayıcı bölge silme hızlı, kolay gen bozulma yönteminde bir streptokok türleri göstermek için gerçekleştirildi. Ayrıca, bir gtfB-kesintiye zorlanma aynı şekilde oluşturulur. GtfC ve gtfB tarafından kodlanmış glucosyltransferases katkıda bulunmak için cariogenic diş biyofilm geliştirme5,6. Vahşi türü biyofilm oluşturmayan yetenekler (S. mutans çoğunlukla WT), gtfCsoy-kesintiye zorlanma (S. mutans çoğunlukla ΔgtfC) ve gtfB-kesintiye zorlanma (S. mutans çoğunlukla ΔgtfB) değerlendirildi fenotipik karşılaştırmalı analizler için. Bu iletişim kuralı gene bozulma için ek bir tür için bir iki adım yöntemi uygulanması genişletir ve çalışmalar gen fonksiyonunu kullanabilirsiniz takson daha geniş bir yelpazesi için değiştirilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptococus mutans</td>
			<td>Stock strain in the lab.</td>
			<td></td>
			<td>Wild-type strain (Strain UA159)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating disruption apparatus</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>GM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic genes</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Astec</td>
			<td>PC-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td>Custom-ordered</td>
			<td>35 bases in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>R045A</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91202</td>
			<td>DNA extraction from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band cutter</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>DU 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1652086</td>
			<td>0.2-cm gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaeropack</td>
			<td>Mitsubishi Gas Chemical</td>
			<td>A-03</td>
			<td>Anaerobic culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion broth</td>
			<td>Becton, Dickinson</td>
			<td>237500</td>
			<td>Bacterial culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>195-11531</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>057-07151</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>For biofilm development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td>For biofilm staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a gene-disrupted streptococcus mutans strain without gene cloning

Tipik yöntemleri için belirli bir gen işlevini aydınlatma vahşi tipi zorlanma ve faiz gen getirilmiş bir yük karşılaştırmalı fenotipik analizlerini içerir. Uygun antibiyotik direnci marker gen içeren bir gen-bozulma DNA yapısı gen kesintiye suşları bakterilerde nesil için yararlıdır. Ancak, Gen Klonlama adımlar gerektirir, geleneksel inşaat yöntemleri karmaşık ve zaman alıcı protokolleri içerir. Burada, Streptococcus mutans çoğunlukla hedeflenen gene bozulma için nispeten facile, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem 2-adım füzyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) bozulma yapý ve elektroporasyon genetik dönüşüm oluşturmak için kullanır. Bu yöntem does değil istemek dışında PCR, enzimatik reaksiyon ve ayrıca bozulma yapı tasarım açısından daha büyük esneklik sağlar. Elektroporasyon istihdam yetkili hücreleri hazırlanması kolaylaştırır ve dönüşüm verimliliği artırır. Mevcut yöntem gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.

1st PCR, her ürün boyutunu gösteren Şekil 2 üzerinde % 1'özel jel gözlemlediği gibi yaklaşık 1 kb tahmini boyutu ile iyi anlaşma içinde yapıldı. Şekil 3 2nd PCR ürünlerinin Jel Elektroforez analizini gösterir. Şekil 4 S. mutans çoğunlukla kolonileri bozulma yapý ve koloni PCR ürünleri bir Jel Elektroforez analizi ile dönüştürülmüş gösteri...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning at JoVE.com

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Streptococcus mutans çoğunlukla gen kesintiye üretimi için facile, hızlı ve nispeten ucuz bir yöntem tarif suşları; Bu teknik gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Floresan protein füzyonları üretilmesi<em&gt; Candida</em&gt; Türler

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Kılavuzu RNA memeli sistemler için klonlama

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...