Name: in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Glenn Sanger-Hodgson, spécialiste des médias à la faculté de médecine de l’ex-URSS pour tout son travail dans la production vidéo, l’édition et Voice-over.
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01GM100474 et R01GM072611).

Les méthodes décrites ici et à l’article 2 ont été approuvés par la Florida State University institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) et suit les lignes directrices énoncées dans le Guide du pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire, 8ème édition . Tous les animaux utilisés dans le présent dans le présent protocole sont maison dans une animalerie de laboratoire dédié jusqu'à utilisation. Aucune expérimentation in vivo a été réalisé avant d...

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O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li></ol>

Les procédures décrites ici utilisent des fraîchement isolées débris de myéline CNS brut ou les macrophages primaires de moelle osseuse. Pour réduire les dépenses de l’animales, il est recommandé que les deux cerveaux et les cellules de la moelle osseuse être cueillie dans chacune des souris au moment du sacrifice. Deux chercheurs travaillant ensemble peuvent préparer ces deux matériaux en même temps. Alternativement, les cerveaux peut être stockées à-80 ° C dans du PBS additionné d’antibiotiques av...

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont un lien important entre le système immunitaire inné et adaptatif. Comme antigène présentant des cellules (CPA), ils peuvent communiquer avec via les deux présentation de l’antigène, les lymphocytes et cytokine release1,2,3. Cependant, comme les phagocytes professionnels, leur fonction principale est de clairement pathogènes, cellules âgées et les débris cellulaires1,4. Suite à une blessure de la moelle épinière (SCI), des quantités considérables de débris de la myéline est généré à partir des oligodendrocytes mourants, le type de cellule responsable de la CNS axon myélinisation5. Nous et autres avons montré que dégagement des débris de la myéline est avant tout la responsabilité d’infiltration de BMDMs5,6,7. Toutefois, au sein de la moelle épinière engouffrement de sites des débris de la myéline a été suggéré de transférer ces cellules normalement anti-inflammatoires vers un état pro-inflammatoire5,8,9. Comme des médiateurs clés de la neuro-inflammation de la moelle épinière lésée, BMDMs sont des objectifs cliniques importants.
Afin d’étudier l’influence de BMDMs dans la moelle épinière lésée, nous avons développé un modèle in vitro pour étudier directement comment BMDMs répondre aux débris de la myéline. Afin d’améliorer la pertinence biologique, tant primaires BMDMs murins et les débris de la myéline fraîchement isolées sont utilisées dans ces enquêtes. Par conséquent, les méthodes présentées ici également détaillent l’isolement et la culture de BMDMs murins primaires et une technique de dégradé mis à jour le saccharose utilisée pour isoler les CNS murin dérivé myéline débris10,11,12. Débris de la myéline peut porter facilement avec un colorant fluorescent, carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE), pour suivre que son internalisation par CFSE BMDMs. est bien adaptée pour cette application, car il est non cytotoxiques et son permis étroit spectre de fluorescence multiplexage avec autre fluorescent sondes13,14. Après la phagocytose, la myéline débris lipides sont transportés à travers les lysosomes et empaquetées comme les lipides neutres dans les gouttelettes de lipides intracellulaires5. Afin de quantifier cette accumulation de lipides intracellulaires, nous présentons un O huile de rouge (ORO) coloration méthode optimisée pour l’analyse quantitative d’image. Cette méthode de coloration simple produit des résultats reproductibles robustes et15de la quantification. Ces méthodes facilitent l’étude de la myéline débris phagocytose et lipides rétention de matériel spécialisé limitée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="669">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">DMEM</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:115px;">SH30243.01</td>
			<td style="width:225px;">High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:180px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:115px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:225px;">100X Solution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">New Born Calf Serum (NCS)</td>
			<td style="width:149px;">Rocky Mountain Biologics</td>
			<td style="width:115px;">NBS-BBT-5XM</td>
			<td style="width:225px;">United States Origin</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:180px;">NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]&#160;</td>
			<td style="width:149px;">ATCC</td>
			<td style="width:115px;">CCL-1</td>
			<td style="width:225px;">L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">24-well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">10062-896&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:180px;">Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:149px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:115px;">639960</td>
			<td style="width:225px;">Polystyrine, 145/20mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">C34570</td>
			<td style="width:225px;">DMSO for Reconsitution Provided</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Fluoro-gel with Tris Buffer&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">17985-11</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:180px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">O0625</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:180px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Materials</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">326823</td>
			<td style="width:225px;">Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:180px;">SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">369650</td>
			<td style="width:225px;">SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Hand Held Rotary Homogenizer</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Science</td>
			<td style="width:115px;">08-451-71</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont des leucocytes matures qui servent un rôle physiologique essentiel comme les phagocytes professionnels capable d’effacer une variété de particules. Normalement, les BMDMs sont restreints de système nerveux central (CNS), mais suite à une blessure, ils peuvent facilement s’infiltrer. Une fois dans le tissu lésé de CNS, BMDMs sont le type de cellules primaires responsable de l’apurement des débris cellulaires dérivées de blessures, y compris de grandes quantités de débris de myéline riche de lipides. Les ramifications neuropathologiques de l’infiltration et la myéline phagocytose de débris BMDM dans le système nerveux central sont complexes et pas bien compris. Les protocoles décrits ici, permettent l’étude directe in vitro de BMDMs dans le contexte des blessures de la CNS. Nous couvrons murin BMDM isolement et culture, préparation de débris de la myéline et tests pour évaluer la phagocytose de débris BMDM la myéline. Ces techniques produisent des résultats quantifiables robustes sans le besoin d’équipement spécialisé significatif ou matériaux, mais peuvent être facilement personnalisés pour répondre aux besoins des chercheurs.

Traitement des BMDMs avec CFSE étiqueté les débris de la myéline devrait produire une internalisation claire (Figure 2). Un temps de 3 heures interaction est suffisant pour BMDMs à phagocyter assez débris de myéline supplémentaire pour la détection en aval robuste, accumulation intracellulaire peut être observée avec aussi peu que 1 heure d’interaction. Cependant, quelques débris de la myéline peut toujours être présent à la surface des cellules après le lavage. Ceci peut ...

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In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Nous présentons des méthodes pour évaluer la capacité phagocytaire des primaires macrophages dérivés de la moelle osseuse murines utilisant des débris de la myéline fluorescent étiquetés et coloration de gouttelettes de lipides intracellulaires.

In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

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