Name: in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

Die Autoren möchten Glenn Sanger-Hodgson, Medien-Spezialist an der FSU College of Medicine für seine Arbeit in video-Produktion, Bearbeitung und Voice-over zu danken.
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01GM100474 und R01GM072611) unterstützt.

Die Methoden hier beschrieben und in Abschnitt 2 von der Florida State University institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und folgt die Vorgaben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren,8 Auflage . Alle Tiere, die in diesem in diesem Protokoll verwendeten sind Haus in einem speziellen Labor Tier bis zur Verwendung. Keine in-Vivo -Experimente wurde durchgeführt vor opfern. Tierzahlen beruhten auf experimentelle Notwendigkeit durchschnittlic...

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	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+function+of+the+macrophage.">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li><li>Cavaillon, J. 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O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li></ol>

Die hier beschriebenen Verfahren nutzen frisch isolierte Rohöl CNS Myelin Schutt und primäre Knochenmark stammenden Makrophagen. Um tierische Ausgaben zu reduzieren, empfehlen wir, die beiden Gehirne und Knochenmarkzellen von jeder Maus zum Zeitpunkt des Opfers geerntet werden. Zwei Forscher gemeinsam können beide Materialien gleichzeitig zubereiten. Alternativ können Gehirne bei-80 ° C in PBS mit Antibiotika vor dem Myelin Schutt Isolierung ergänzt gespeichert werden. Es ist gewesen, dass unsere Erfahrung, die Geh...

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind ein wichtiges Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunsystem. Als antigenpräsentierende Zellen (APCs) sie können mit Lymphozyten über beide Antigenpräsentation kommunizieren und Cytokine release1,2,3. Ihre primäre Funktion ist jedoch als professionelle Phagozyten, Krankheitserreger, gealterten Zellen und Zelltrümmer1,4löschen. Nach einer Rückenmarksverletzung ("SCI") ist verantwortlich für CNS Axon Myelinisierung5Zelltyp erhebliche Mengen von Myelin Schutt von sterbenden Oligodendrozyten generiert. Wir und andere haben gezeigt, dass Clearance von Myelin Schutt in erster Linie die Verantwortung der Infiltration BMDMs5,6,7. Allerdings wurde in Verletzung des Rückenmarks Websites Engulfment von Myelin Schutt vorgeschlagen, diese normalerweise entzündungshemmenden Zellen auf einer Pro-entzündliche Zustand5,8,9verschoben. Als wichtige Vermittler von Neuroinflammation im verletzten Rückenmark sind BMDMs wichtige klinische Ziele.
Um den Einfluss der BMDMs im verletzten Rückenmark untersuchen zu helfen, haben wir eine in-Vitro -Modell, um direkt zu studieren, wie BMDMs auf Myelin Schmutz reagieren entwickelt. Zur Verbesserung der biologischen Relevanz sind primären murinen BMDMs und frisch isolierte Myelin Ablagerungen in diesen Untersuchungen verwendet. Als solche, die hier vorgestellten Methoden auch detailliert die Isolation und die Kultur der primären murinen BMDMs und eine modifizierte Saccharose gradient Technik, murine CNS isolieren abgeleitet Myelin Schutt10,11,12. Myelin Schmutz kann leicht beschriftet werden, mit einem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-), zu verfolgen, die die Internalisierung von BMDMs. CFSE-für diese Anwendung geeignet ist, denn es ist nicht zytotoxisch und seine schmalen Fluoreszenzspektrum Genehmigungen Multiplexen mit anderen fluoreszierende Sonden13,14. Nach Phagozytose Myelin Schutt Lipide sind durch den Lysosomen transportiert und als neutralen Lipiden in intrazellulären Lipid Tröpfchen5verpackt. Um diese intrazellulären Lipid-Ansammlung zu quantifizieren, präsentieren wir ein Öl rot O (ORO) Färbung Methode optimiert für quantitative Bildanalyse. Diese einfache Färbung Methode produziert robuste reproduzierbare Ergebnisse und Quantifizierung15. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Myelin Schutt Phagozytose und Lipid-Aufbewahrung mit begrenzten Spezialausrüstung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="669">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">DMEM</td>
			<td style="width:149px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:115px;">SH30243.01</td>
			<td style="width:225px;">High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:180px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:115px;">30-002-CI</td>
			<td style="width:225px;">100X Solution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">New Born Calf Serum (NCS)</td>
			<td style="width:149px;">Rocky Mountain Biologics</td>
			<td style="width:115px;">NBS-BBT-5XM</td>
			<td style="width:225px;">United States Origin</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:180px;">NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]&#160;</td>
			<td style="width:149px;">ATCC</td>
			<td style="width:115px;">CCL-1</td>
			<td style="width:225px;">L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">24-well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">10062-896&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:180px;">Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:149px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:115px;">639960</td>
			<td style="width:225px;">Polystyrine, 145/20mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td style="width:149px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">C34570</td>
			<td style="width:225px;">DMSO for Reconsitution Provided</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Fluoro-gel with Tris Buffer&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">17985-11</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:180px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">O0625</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:180px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Materials</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">326823</td>
			<td style="width:225px;">Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:180px;">SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:149px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">369650</td>
			<td style="width:225px;">SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Hand Held Rotary Homogenizer</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Science</td>
			<td style="width:115px;">08-451-71</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages

Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) sind reife Leukozyten, die eine wichtige physiologische Rolle als professionelle Phagozyten in der Lage, der clearing-einer Vielzahl von Teilchen dienen. Normalerweise BMDMs werden daran gehindert, das zentrale Nervensystem (ZNS), aber nach einer Verletzung können sie ohne weiteres zu infiltrieren. Einmal eignen sich in das verletzte Gewebe CNS, BMDMs Primärzelle verantwortlich für die Abfertigung von Verletzungen abgeleitet Zelltrümmer, einschließlich große Mengen an Lipid reichen Myelin Schutt. Die neuropathologische Auswirkungen BMDM Infiltration und Myelin Schutt Phagozytose innerhalb des ZNS sind komplex und nicht gut verstanden. Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die direkten in-vitro- Untersuchung der BMDMs im Rahmen der CNS Verletzung. Wir decken murinen BMDM Isolierung und Kultur, Myelin Schutt Vorbereitung und Tests um BMDM Myelin Schutt Phagozytose zu beurteilen. Diese Techniken robuste quantifizierbare Ergebnisse ohne signifikante spezialisierte Geräte oder Materialien zu produzieren, aber können leicht angepasst werden, um die Bedürfnisse der Forscher.

Behandlung von BMDMs mit CFSE beschriftet Myelin Ablagerungen sollten klare Internalisierung (Abbildung 2) ergeben. Während eine 3-stündigen Interaktionszeit für BMDMs, genügend zusätzlichen Myelin Schutt für robuste nachgelagerten Erkennung phagozytieren ausreicht, kann mit weniger als 1 Stunde von Interaktion intrazelluläre Akkumulation beobachtet werden. Jedoch kann einige Myelin Trümmer nach dem Waschen immer noch auf der Zelloberfläche vorhanden sein. Dies ist möglicherweise a...

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In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

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Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

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