Name: cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

الكتاب امتنان الاعتراف بالعمل للدكتور محمد نافاب والن فوغلمان ريدي سرينفاسا لدورها الرئيسي في تنمية تكرارات السابقة من هذا الطراز. T.A.A. معتمد من قبل معهد ملبورن الملكي الجامعة نائب مدير الجامعة "زمالات ما بعد الدكتوراه". جعفر و AH معتمدة بتمويل المشروع منحة 1108792. معتمد المعارف التقليدية التي تمنح K08AI08272 المعاهد الوطنية للصحة، "منح" المعاهد الوطنية للصحة/نكتس # µL1TR000124 من المعاهد الوطنية للصحة.

أجريت جميع التجارب باستخدام العينات البيولوجية البشرية بموافقة الأخلاق من الجامعة "كاليفورنيا لوس أنجليس"، ولوس أنجليس ولجنة "الأخلاقيات البشرية مستشفى الفريد"، ملبورن.
 ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات الدالة fluorochrome الحميد المقايسة (انظر المناقشة) 32. أدناه...

ويوفر البروتوكول الموصوفة هنا أداة قوية للإجابة على الأسئلة البحثية الهامة فيما يتعلق بالدور وظيفة الحميد في تصلب الشرايين، والأمراض التي تصيب البشر. يوضحها المقايسة محتوى الدهن الحميد بيروكسايد كل مغ من HDL-C باستخدام التضخيم الانزيمية (HRP). ويتجنب هذا النهج القيود المعروفة لفحوصات وظيفة ...

أمراض القلب والأوعية الدموية تصلب الشرايين (الرسوم التعويضية) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1،2. وقد أظهرت الدراسات الوبائية أن انخفاض مستويات البروتين الدهني الكثافة (HDL) الكوليسترول عموما ترتبط عكسيا مع المخاطر لتطوير تصلب الشرايين1،2. على الرغم من اعتماد العديد من الدراسات بدور أثيروبروتيكتيفي الحميد1،2، هو الآلية التي يخفف الحميد بدء وتطور تصلب الشرايين معقدة 3،4. ومن ثم، اقترح أن هيكل معقد ووظيفة الحميد بدلاً من المستوى المطلق قد التنبؤ أكثر دقة بتصلب الشرايين 5،6،،من78. تحدث عدة الحميد البروتين والدهن التغييرات التركيبية التي تنال من الدالة الحميد في الولايات الملتهبة مثل تصلب الشرايين. هذه ط) خفض بنسبة الكولسترول في الدم افلوكس المحتملة 9، ثانيا) إنقاص للالتهابات وزيادة البروتينات برو-الالتهابات المرتبطة بالحميد 6،7، ثالثا) انخفاض مستويات مضادات الأكسدة عامل والنشاط و HDLs القدرة تمنع أكسدة "البروتين الدهني منخفض الكثافة" (لدلوكس)10 والرابع) زيادة الدهن هيدرو فوق أكسيد تركيز المحتوى والأكسدة النشاط (هدلوكس)9،11. فحوصات قوية أن تقييم وظائف بليوتروبيك الحميد (مثل efflux الكولسترول، الدالة المضادة للأكسدة) قد تكمل تصميم الحميد-HDL-C في العيادة.
هو عادة بالأساليب المستندة إلى الخلية مثل الكوليسترول efflux المقايسة8،12،،من1314تقييم الدالة الحميد. هذه الأساليب والقيود الرئيسية بما في ذلك تغايرية مهمة فيما يتعلق بأنواع الخلايا المستخدمة ونوع قراءات أفادت، والافتقار إلى التوحيد وآثار الخلط الثلاثية 7،15. هذه العيوب تثير صعوبات لدراسات سريرية كبيرة16. فحوصات مجانية من الخلية قد تعطي تدابير أقوى الحميد وظيفة مقارنة بفحوصات يستند إلى الخلية. افلوكس نسبة الكولسترول في الدم واحدة من أهم وظائف الحميد ولكن فإنه لا يمكن تحديده إلا بفحوصات يستند إلى الخلية. نهج أخرى لتحديد دالة الحميد مثل البروتيوميات17،،من1819،20،21،،من2223، 24 وفحوصات إنزيمية الوحيدات يستند إلى الخلية الحميد الدالة 17،،من2225 لا تم توحيد ولا يمكن استخدامها في الدراسات الإنسانية الواسعة النطاق.
وقد هدل الهامة المضادة للأكسدة أثيروبروتيكتيفي تأثير5،6،،من78. وقد تحدد وظيفة المضادة للأكسدة الكوليسترول الجيد حضور LDL في السابق الخلية الحرة فحوصات فلوروميتريك 26. هذه الأساليب فلوروميتريك البيوكيميائية الحميد مضادات الأكسدة مهمة وضعت أصلاً نافاب محمد والن فوغلمان و الزملاء على26. على الرغم من أن العديد من الدراسات البشرية قد استخدمت هذه الأساليب لتحديد الحميد الدالة 17،،من1819،،من2021،22،23 ،24، الدهون (الكوليسترول الجيد)-المادة الدهنية (LDL) والتفاعلات fluorochrome الدهن قد تحد من إمكانية تكرار نتائج لهذه الخلية الحرة غير الانزيمية البيوكيميائية فحوصات الحميد الدالة27،28.
الفائدة الأخيرة ركزت على العواقب الوظيفية لأكسدة الكوليسترول الجيد هو نتيجة لأكسدة كل من الدهون والبروتينات داخل الحميد 27،،من2930. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن أكسدة الكوليسترول الجيد يضعف الحميد الدالة 27،،من2930. الحميد دوراً رئيسيا في النقل بيروكسايد المادة الدهنية وهي المتعلقة بكمية عالية من الدهون الأكاسيد الفوقية الشاذ الحميد الدالة. وبالتالي يمكن استخدامها لتحديد الحميد الدالة 9،17،،من2031 الحميد محتوى الدهون بيروكسايد ونظرا لمحدودية المعروفة لفحوصات مسبقة الحميد الدالة7، 15،،من2732، قمنا بتطوير أسلوب بديل فلوروميتريك التي يوضحها الحميد دهن محتوى بيروكسايد (هدلوكس) 32. يستند هذا الأسلوب الإنزيم الفجل البيروكسيديز (HRP) و fluorochrome Amplex الأحمر التي يمكن تحديدها كمياً (بدون الكوليسترول أوكسيديز) محتوى الدهن بيروكسايد كل ملغ من الكوليسترول الجيد-ج 32. البيوكيميائية مبدأ المقايسة يرد في الشكل 1. وقد أظهرنا أن هذا النهج القائم على الأسفار ليس لديه قيود مسبقة الحميد الدالة فحوصات27،28. تم زيادة صقل هذا التحليل وموحدة في المختبر حيث أنه يمكن استخدامه موثوق في الدراسات الإنسانية واسعة النطاق حتى مع البلازما cryopreserved 32،،من3334، 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42-قراءات من هذا الإنزيم يرتبط مع قراءات لفحوصات المستندة إلى خلية تم التحقق من صحتها، تدابير بديلة لأمراض القلب والأوعية الدموية والتهاب النظامية والخلل المناعي وتعمل يرتبط بها من مخاطر القلب والأوعية الدموية والايض 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39-هنا، يمكننا وصف هذا الأسلوب بسيطة، لكنها قوية لقياس الدهن الحميد بيروكسايد المحتوى (هدلوكس). يمكن استخدام هذا التحليل كأداة للإجابة على الأسئلة البحثية الهامة فيما يتعلق بالدور وظيفة الكوليسترول الجيد في الأمراض البشرية فيها التهاب النظامية والأكسدة والدهون المؤكسدة لها دور رئيسي (مثل تصلب الشرايين)32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent</td>
			<td>Pointe Scientific</td>
			<td>H7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red reagent.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Esterase.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cholesterol Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Resorufin fluorescense Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Reaction Buffer.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL Cholesterol Automated Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>TR39601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 200, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>14-488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>&#160;14-387--955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 2.01 software</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Plate reader</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein

مستويات الكوليسترول في الدم (HDL-C) منخفض الكثافة lipoprotein واحدة من تنبؤ السلبية مستقلة أقوى من أمراض القلب والأوعية الدموية تصلب الشرايين (الرسوم التعويضية). هيكل ووظيفة الحميد بدلاً من HDL-C يمكن التنبؤ بدقة أكثر تصلب الشرايين. تحدث عدة الحميد البروتين والدهن التغييرات التركيبية التي تنال من الدالة الحميد في الولايات الملتهبة مثل تصلب الشرايين. الدالة الحميد يتحدد عادة بالخلية على أساس فحوصات مثل الإنزيم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم ولكن هذه الاختبارات لها عدة عيوب عدم توحيد. فحوصات مجانية من الخلية قد تعطي تدابير أقوى الحميد وظيفة مقارنة بفحوصات يستند إلى الخلية. ويضعف أكسدة الحميد الحميد الدالة. الحميد دوراً رئيسيا في النقل بيروكسايد المادة الدهنية وهي المتعلقة بكمية عالية من الدهون الأكاسيد الفوقية الشاذ الحميد الدالة. ينبغي النظر في التفاعلات الدهن-التحقيق عند تفسير نتائج الأسفار غير الانزيمية فحوصات لقياس حالة الأكسدة الدهنية. وهذا دافع لنا لتطوير أسلوب الانزيمية الخلية الحرة بيوكيميائية لتقييم الحميد بيروكسايد محتوى الدهون (هدلوكس) أن يسهم في الخلل الوظيفي الحميد. يستند هذا الأسلوب على البيروكسيديز الفجل إنزيم (HRP) و fluorochrome Amplex الأحمر التي يمكن تحديدها كمياً (بدون الكوليسترول أوكسيديز) محتوى الدهن بيروكسايد كل مغ من HDL-C. هنا بروتوكول تحديد ديسكريبيدفور HDL-وبيروكسيد استخدام الكاشف فلوروتشرومي. يمكن الحد من تقلب المقايسة بالتوحيد الصارم للظروف التجريبية. أعلى هدلوكس القيم المرتبطة بانخفاض وظيفة المضادة للأكسدة الكوليسترول الجيد. قراءات من هذا التحليل المقترنة مع قراءات لفحوصات المستندة إلى خلية تم التحقق من صحتها، تدابير بديلة لأمراض القلب والأوعية الدموية والتهاب النظامية والخلل المناعي وتعمل يرتبط بها من مخاطر القلب والأوعية الدموية والايض. وهذا النهج التقني هو وسيلة قوية لتقييم دالة الكوليسترول الجيد في الأمراض البشرية فيها التهاب النظامية والأكسدة والدهون المؤكسدة لها دور رئيسي (مثل تصلب الشرايين).

يتم إضافة 50 ميليلتر من كل عينة الحميد في كل بئر كما في الخطوة 7، 3. 50 ميليلتر من حل HRP 5 يو/مليلتر (0.25 U) ثم تضاف إلى كل جيدا كما هو الحال في الخطوة 7، 5. هي المحتضنة عينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية كما هو الحال في الخطوة 7، 6. ثم تتم إضافة 50 ميليلتر من كاشف فلوروتشرومي في كل بئر ك?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

يصف لنا هنا مقايسة الخلية الحرة بيوكيميائية فلوروميتريك للبت في هدل-وبيروكسيد. هذا الفحص السريع واستنساخه يمكن استخدامها لتحديد دالة الحميد في دراسات واسعة النطاق، ويمكن أن تسهم في فهمنا للدالة الكوليسترول الجيد في الأمراض التي تصيب البشر.

الخلية الحرة البيوكيميائية المقايسة الانزيمية فلوروميتريك لقياس الفائق وبيروكسيد في البروتين الدهني العالي الكثافة

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...