Name: cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

Les auteurs remercient les travaux du Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman et Reddy Srinivasa pour leur rôle clé dans le développement d’itérations précédentes de ce modèle. T.A.A. est pris en charge par un RMIT University rectorale bourse postdoctorale. AJ et AH sont pris en charge par NHMRC projet grant 1108792. TK est pris en charge par NIH accorde NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # µL1TR000124.

toutes les expériences à l’aide d’échantillons biologiques humains ont été effectués avec l’approbation de l’éthique de l’Université de Californie à Los Angeles, Los Angeles et le Comité de l’éthique humaine Alfred Hospital, Melbourne.
 Remarque : il existe de nombreuses variations de la fonction de fluorochrome HDL Assay (Voir discussion) 32. Ci-dessous, nous allons décrire le protocole qui donne des résultats plus cohérents et reproductibl...

Le protocole décrit ici offre un outil robuste pour répondre à des questions de recherche importantes concernant le rôle de fonction de HDL dans l’athérosclérose et des maladies humaines. L’essai quantifie la teneur en peroxyde lipidique HDL par mg de HDL-C en utilisant l’amplification enzymatique (HRP). Cette approche évite les limitations connues de tests de fonction HDL préalables (par exemple l’essai de l’efflux de cholestérol) y compris une hétérogénéité significative en ce qui concerne les t...

Les maladies cardiovasculaires athérosclérotiques (CVD) sont la principale cause de décès dans le monde1,2. Les études épidémiologiques ont montré que les faibles niveaux de cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL) sont généralement inversement associés au risque pour le développement de l’athérosclérose1,2. Bien que plusieurs études prend en charge un rôle atheroprotective HDL1,2, le mécanisme par lequel les HDL atténue l’initiation et la progression de l’athérosclérose est complexe 3,4. Ainsi, il a été suggéré que la structure complexe et la fonction de HDL au lieu du niveau absolu peuvent prédire avec plus de précision l’athérosclérose 5,6,7,8. Plusieurs HDL protéines et lipides de compositions changements qui portent atteinte à la HDL se produisent dans les États inflammatoires telles que l’athérosclérose. Ces i) réduire son cholestérol efflux potentiels 9, ii) réduction anti-inflammatoires et augmentation des protéines pro-inflammatoires associées aux HDL 6,7, niveaux de facteur d’antioxydants diminution iii) et de l’activité et de HDL capacité d’inhiber l’oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDLox)10 et iv) augmenter les lipides hydroperoxyde contenu et redox activité (HDLox)9,11. Dosages robustes qui évaluent les fonctions pleotropic de HDL (par exemple l’efflux de cholestérol, fonction antioxydante) peuvent compléter le dosage du HDL-C-HDL dans la clinique.
La fonction de HDL est habituellement évaluée par des méthodes basées sur les cellules comme les efflux de cholestérol dosage8,12,13,14. Ces méthodes ont des limites importantes, y compris une hétérogénéité significative en ce qui concerne les types de cellules utilisées, le type de lecture a signalé, l’absence de normalisation et effets confusionnels des triglycérides 7,15. Ces inconvénients soulèvent des difficultés pour les grandes études cliniques16. Dosages acellulaire peuvent accorder des mesures plus robustes de fonction de HDL par rapport aux analyses cellulaires. L’efflux de cholestérol est l’une des fonctions plus importantes de HDL, mais il ne peut être déterminée par des analyses cellulaires. Autres approches pour déterminer la fonction de HDL comme protéomique17,18,19,20,21,22,23, essais chimiotactisme sur les cellules monocytes de HDL fonction 17,22,25 et 24 n’ont pas été normalisées et ne peut être utilisés dans les études chez l’homme à grande échelle.
HDL a important antioxydant atheroprotective effet5,6,7,8. La fonction antioxydante de HDL a été déterminée en présence de LDL dans la précédente cellule dosages fluorimétrique libre 26. Ces méthodes fluorimétrique biochimiques de la fonction antioxydante HDL ont été développées par Mohamad Navab et Alan Fogelman et leurs collègues26. Bien que plusieurs études sur les humains ont utilisé ces méthodes pour déterminer les HDL fonction 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipides (HDL)-lipides (LDL) et les interactions lipide-fluorochrome peuvent limiter la reproductibilité de ces épreuves biochimiques non-enzymatique libre cellulaire du HDL fonction27,28.
Intérêt récent a mis l’accent sur les conséquences fonctionnelles de l’oxydation de HDL qui est le résultat de l’oxydation des lipides et de protéines dans les HDL 27,29,30. Des études antérieures ont démontré que l’oxydation du HDL altère HDL fonction 27,29,30. HDL a un rôle majeur dans le transport de peroxydes lipidiques et élévé de peroxydes lipidiques est liée à la fonction anormale de HDL. Ainsi les teneur en peroxyde lipidique HDL peut être utilisée pour déterminer les HDL fonction 9,17,20,31 et étant donné les limitations connues des essais préalables de HDL fonction7, 15,27,32, nous avons développé une méthode fluorimétrique alternative qui quantifie les HDL lipides teneur en peroxyde (HDLox) 32. Cette méthode s’inspire de la peroxydase de raifort (HRP) de l’enzyme et le fluorochrome rouge Amplex qui permet de quantifier (sans oxydase de cholestérol) la teneur en lipides peroxydes par mg de HDL-C 32. Principe du dosage biochimique est montré dans la Figure 1. Nous avons montré que cette approche axée sur la fluorescence n’a pas les limites des tests de la fonction de HDL préalable27,28. Ce test a été encore raffiné et standardisé dans notre laboratoire afin qu’il fiable peut être utilisé dans les études chez l’homme à grande échelle même avec cryoconservés plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lecture de ce test est associée avec lectures d’essais basés sur les cellules validés, les mesures de substitution des maladies cardiovasculaires, l’inflammation systémique, dysfonctionnement immunitaire et phénotypes de risques cardiovasculaires et métaboliques 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. nous décrivons ici, cette méthode simple mais robuste pour mesurer la teneur en peroxyde lipidique HDL (HDLox). Ce dosage peut servir comme un outil pour répondre à des questions de recherche importantes concernant le rôle de fonction de HDL dans la maladie humaine où l’inflammation systémique, le stress oxydatif et lipides oxydés ont un rôle clé (telles que l’athérosclérose)32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent</td>
			<td>Pointe Scientific</td>
			<td>H7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red reagent.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Esterase.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cholesterol Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Resorufin fluorescense Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Reaction Buffer.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL Cholesterol Automated Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>TR39601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 200, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>14-488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>&#160;14-387--955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 2.01 software</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Plate reader</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein

Les lipoprotéines de haute densité faible taux de cholestérol (HDL-C) est l’un des plus puissants prédicteurs négatifs indépendants d’athérosclérose cardiovasculaire (MCV). La structure et la fonction des HDL et non HDL-C peuvent prédire avec plus de précision l’athérosclérose. Plusieurs HDL protéines et lipides de compositions changements qui portent atteinte à la HDL se produisent dans les États inflammatoires telles que l’athérosclérose. Fonction de HDL est généralement déterminée par la cellule en fonction des tests comme le test de l’efflux de cholestérol, mais ces tests ont plusieurs inconvénients manque de normalisation. Dosages acellulaire peuvent accorder des mesures plus robustes de fonction de HDL par rapport aux analyses cellulaires. Oxydation de HDL altère la fonction de HDL. HDL a un rôle majeur dans le transport de peroxydes lipidiques et élévé de peroxydes lipidiques est liée à la fonction anormale de HDL. Les interactions lipide-sonde devraient considérer quelle interprétation des résultats de la fluorescence non enzymatique tests pour mesurer l’état d’oxydation lipidique. Cela a motivé nous développions une méthode enzymatique acellulaire biochimique pour évaluer des HDL peroxyde contenu lipidique (HDLox) qui contribue à la dysfonction de HDL. Cette méthode s’inspire de la peroxydase de raifort (HRP) de l’enzyme et le fluorochrome rouge Amplex qui permet de quantifier (sans oxydase de cholestérol) la teneur en lipides peroxydes par mg de HDL-C. Voici un protocole describedfor détermination de la peroxydation lipidique HDL utilisant le réactif de fluorochrome. Variabilité du dosage peut être réduite par une normalisation stricte des conditions expérimentales. HDLox des valeurs plus élevées sont associés à la fonction d’antioxydant HDL réduite. La lecture de ce test est associée de lectures d’essais basés sur les cellules validés, les mesures de substitution des maladies cardiovasculaires, l’inflammation systémique, dysfonctionnement immunitaire et phénotypes de risques cardiovasculaires et métaboliques. Cette approche technique est une méthode fiable pour évaluer la fonction des HDL dans la maladie humaine où l’inflammation systémique, le stress oxydatif et lipides oxydés ont un rôle clé (telles que l’athérosclérose).

50 µL de chaque échantillon de HDL sont ajoutés dans chaque puits comme au point 7.3. 50 µL de solution HRP 5 U/mL (0,25 U) sont ensuite ajoutés dans chaque puits comme à l’étape 7,5. Les échantillons sont incubés pendant 30 min à 37 ° C, comme dans l’étape 7,6. 50 µL de réactif de fluorochrome sont ensuite ajoutés dans chaque puits comme à l’étape 7,7 (concentration finale de 300 µM). L’affichage fluorescent (en foncé) est ensuite évalué chaque minute pendant...

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Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Nous décrivons ici un dosage fluorimétrique acellulaire biochimique pour dosage du HDL-la peroxydation lipidique. Ce test rapid et reproductible peut servir à déterminer la fonction de HDL dans les études à grande échelle et peut contribuer à notre compréhension de la fonction de HDL dans la maladie humaine.

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