Name: cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

המחברים מאשר בתודה את העבודה של ד ר פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן Reddy סריניוואסה עבור שלהם תפקיד מפתח בפיתוח של חזרות קודמות של מודל זה. T.A.A. נתמך על ידי RMIT אוניברסיטת סגן-הנשיא של הבתר-דוקטורים. AJ AH נתמכים על ידי מענק פרוייקט NHMRC 1108792. TK נתמך על-ידי NIH מעניקה NIH K08AI08272, גרנט NIH/NCATS # µL1TR000124.

כל הניסויים באמצעות דגימות ביולוגיות האדם בוצעו עם אתיקה אישור מהאוניברסיטה של קליפורניה בלוס אנג'לס, לוס אנג'לס, ועדת האתיקה האנושית של החולים אלפרד, מלבורן.
 הערה: ישנן וריאציות רבות של הפונקציה fluorochrome HDL Assay (ראה דיון) 32. להלן נתאר את פרוטוקול זה נותן תוצאות עק...

הפרוטוקול המתואר כאן מציע כלי חזקים כדי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL טרשת עורקים, מחלות אנושיות. וזמינותו מכמת את ה-HDL השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C באמצעות הגברה אנזימטי (HRP). גישה זו מונע המגבלות המוכרות של מבחני תפקוד HDL מוקדמת (למשל וזמינותו בזרימת כולסטרול) כו...

מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD) הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם1,2. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי רמות נמוכות של כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) המשויכים בדרך כלל הפוך הסיכון להתפתחות טרשת עורקים1,2. למרות מספר מחקרים תומכים תפקיד atheroprotective עבור ה-HDL1,2, המנגנון שבאמצעותו HDL נחלש החניכה, ההתקדמות של טרשת עורקים הוא מורכב 3,4. לפיכך, הוצע כי מורכבות המבנה והתפקוד של HDL ולא רמה מוחלטת עלולה יותר לחזות במדויק טרשת עורקים 5,6,7,8. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. אלו i) להפחית את פוטנציאל בזרימת 9שלה כולסטרול, ii) ירידה אנטי דלקתיות, ולהגביר את ה-HDL-הקשורים חלבונים פרו דלקתיים 6,7, של רמות פקטור של ירידה iii) נוגד חמצון ופעילות ו HDLs היכולת לעכב את חמצון של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLox)10 ו- iv) להגדיל את השומנים hydroperoxide התוכן של חמצון-חיזור פעילות (HDLox)9,11. מבחני חזקים להעריך את הפונקציות pleotropic של ה-HDL (כגון כולסטרול בזרימת, נוגד חמצון פונקציה) ייתכן משלימים נחישות של HDL-HDL-C במרפאה.
פונקציית ה-HDL הוא בדרך כלל לאומדן מבוססת תא שיטות כגון כולסטרול בזרימת assay8,12,13,14. שיטות אלה יש מגבלות הגדולות כולל הטרוגניות משמעותי לגבי סוגים של תאים בשימוש, סוג הבדיקה דיווח, היעדר סטנדרטיזציה ואפקטים מבלבלים של טריגליצרידים 7,15. מחסרונות אלה מהווים קשיים על מחקרים קליניים גדולים16. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. בזרימת כולסטרול הוא אחד התפקידים החשובים ביותר של ה-HDL, אך זה יכול להיקבע רק על ידי מבחני מבוססת-תא. גישות אחרות כדי לקבוע את פונקציית ה-HDL כגון פרוטאומיקס17,18,19,20,21,22,23, 24 , מונוציט מבוססת תא מבחני כימוטקסיס של HDL פונקציה 17,22,25 לא סטנדרטית ואין אפשרות להשתמש במחקרים בבני אדם בקנה מידה גדול.
HDL יש נוגד חמצון משמעותית atheroprotective אפקט5,6,7,8. הפונקציה נוגד חמצון של HDL נקבע בנוכחות LDL לתא הקודם חינם מבחני fluorometric 26. השיטות fluorometric הביוכימי של HDL נוגד חמצון פונקציה פותחו במקור מאת פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן, הקולגות שלהם26. למרות מחקרים בבני אדם רבים השתמשו בשיטות אלה כדי לקבוע את ה-HDL פונקציה 17,18,19,20,21,22,23 ,24, השומנים (HDL)-שומנים בדם (LDL) ואינטראקציות השומנים-fluorochrome עלולה להגביל הפארמצבטית של אלה תא חינם-אנזימטי הביוכימי מבחני של HDL פונקציה27,28.
הריבית האחרונות התמקדה ההשלכות פונקציונלי של חמצון ה-HDL, שהוא התוצאה של חמצון של שומנים וחלבונים בתוך ה-HDL 27,29,30. מחקרים קודמים הראו כי חמצון של HDL פוגע HDL פונקציה 27,29,30. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. ובכך HDL השומנים חמצן תוכן שניתן להשתמש כדי לקבוע את ה-HDL פונקציה 9,17,20,31 ו נתן את המגבלות המוכרות של מבחני מוקדמת של HDL פונקציה7, 15,27,32, פיתחנו שיטה חלופית fluorometric זה מכמת HDL השומנים תוכן חמצן (HDLox) 32. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C 32. עקרון וזמינותו הביוכימי מוצג באיור1. אנחנו הראו כי גישה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אין המגבלות של27,מבחני תפקוד HDL מוקדמת28. יש כבר מעודן, סטנדרטית במעבדה שלנו כך זה יכול לשמש באופן אמין במחקרים בבני אדם בקנה מידה גדול, אפילו עם פלזמה cryopreserved 32,33,34, עוד יותר assay הזה 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. readout assay זו מזוהה עם המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית מדדים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית, סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך פנוטיפים 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. כאן, אנו מתארים שיטה זו פשוטה, עדיין חזקים כדי למדוד את ה-HDL השומנים חמצן תוכן (HDLox). Assay הזה יכול לשמש ככלי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים)32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent</td>
			<td>Pointe Scientific</td>
			<td>H7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red reagent.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Esterase.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cholesterol Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Resorufin fluorescense Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Reaction Buffer.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL Cholesterol Automated Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>TR39601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 200, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>14-488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>&#160;14-387--955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 2.01 software</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Plate reader</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein

רמות הכולסטרול (HDL-C) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה נמוך הם אחד החזקים ביותר מנבאות שלילי עצמאית של מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD). המבנה והתפקוד של HDL יותר מאשר ה-HDL-C אולי יותר לחזות במדויק טרשת עורקים. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. פונקציית ה-HDL נקבעת בדרך כלל לפי תא מבוסס מבחני כגון כולסטרול בזרימת assay אבל אלה מבחני יש חסרונות רבים, היעדר סטנדרטיזציה. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. HDL חמצון פוגע פונקציית ה-HDL. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. השומנים-בדיקה אינטראקציות להתייחס כאשר מבחני הנמצאות לפרש את התוצאות של זריחה אנזימטי למדידת מצב חמצון השומנים. זה הניע אותנו לפתח שיטה אנזימטי ללא תא ביוכימי כדי להעריך את ה-HDL חמצן תוכן שומני (HDLox) אשר תורם בתפקוד ה-HDL. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C. פרוטוקול זה קביעת describedfor peroxidation HDL-השומנים באמצעות הכימית fluorochrome. השתנות assay יכול להיות מופחת על ידי סטנדרטיזציה קפדנית של תנאי הניסוי. ערכים גבוהים יותר HDLox משויכות פונקציה מופחתת של נוגדי חמצון HDL. Readout assay זו משויכת המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית אמצעים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית פנוטיפים סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך. גישה טכנית זו היא שיטה חזקה כדי להעריך פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים).

50 µL של כל מדגם ה-HDL מתווספים כל טוב כמו שלב 7.3. µL 50 של פתרון HRP 5 U/mL (0.25 U) יתווספו לאחר מכן כל טוב כמו שלב 7.5. דוגמאות מודגרת למשך 30 דקות ב 37 ° C כמו שלב 7.6. µL 50 של ריאגנט fluorochrome יתווספו לאחר מכן כל טוב כמו שלב 7.7 (הריכוז הסופי של 300 מיקרומטר). המדידה פלורסנט (בחושך) ואז שקובעת כל דקה מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...