Name: cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein
Uploaded: 2017-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

लेखक कृतज्ञता इस मॉडल के पहले पुनरावृत्तियों के विकास में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए डॉ मोहम्द Navab, एलन Fogelman और श्रीनिवास रेड्डी के काम स्वीकार करते हैं । T.A.A. एक RMIT विश्वविद्यालय के कुलपति Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है । अज और आह NHMRC परियोजना अनुदान ११०८७९२ द्वारा समर्थित हैं । TK NIH अनुदान NIH K08AI08272, NIH/NCATS ग्रांट # µ l1tr000124 द्वारा समर्थित है ।

मानव जैविक नमूनों का उपयोग कर सभी प्रयोगों को कैलिफोर्निया के लॉस एंजिल्स, लॉस एंजिल्स और अल्फ्रेड अस्पताल मानव नैतिकता समिति, मेलबोर्न विश्वविद्यालय से नैतिकता अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया । <...

प्रोटोकॉल यहां वर्णित महत्वपूर्ण अनुसंधान atherosclerosis और मानव रोग में एचडीएल समारोह की भूमिका के बारे में सवालों के जवाब देने के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है । परख एचडीएल के प्रति मिलीग्राम एचडीएल लिप?...

Atherosclerotic हृदय रोग (सीवीडी) मौत का प्रमुख कारण दुनिया भर में1,2है । जानपदिक रोग विज्ञानी अध्ययनों से पता चला है कि उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन के निंन स्तर (एचडीएल) कोलेस्ट्रॉल आमतौर पर व्युत्क्रम atherosclerosis1,2के विकास के लिए जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं । हालांकि कई अध्ययनों से एचडीएल1,2के लिए एक atheroprotective भूमिका का समर्थन करता है, तंत्र जिसके द्वारा एचडीएल atherosclerosis की दीक्षा और प्रगति को क्षीण कर रहा है, वह जटिल 3,4है । इस प्रकार, यह सुझाव दिया गया है कि जटिल संरचना और एचडीएल के समारोह के बजाय निरपेक्ष स्तर पर और अधिक सही भविष्यवाणी कर सकते है atherosclerosis 5,6,7,8। कई एचडीएल प्रोटीन और लिपिड संरचना परिवर्तन है कि एचडीएल समारोह ख़राब ऐसे atherosclerosis के रूप में भड़काऊ राज्यों में होते हैं । ये i) अपने कोलेस्ट्रॉल समाप्ति संभावित 9, द्वितीय कमी) विरोधी भड़काऊ और वृद्धि एचडीएल-जुड़े समर्थक भड़काऊ प्रोटीन 6,7, iii) कमी एंटीऑक्सीडेंट कारक स्तर और गतिविधि और डेंसिटी क्षमता कम घनत्व लिपोप्रोटीन (LDLox) के ऑक्सीकरण को बाधित करने के लिए10 और iv) वृद्धि लिपिड hydroperoxide सामग्री और redox गतिविधि (HDLox)9,11. मजबूत परख कि एचडीएल के pleotropic कार्यों का मूल्यांकन (जैसे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति, एंटीऑक्सीडेंट समारोह के रूप में) एचडीएल-एचडीएल-सी क्लिनिक में दृढ़ संकल्प का पूरक हो सकता है ।
एचडीएल समारोह आमतौर पर सेल आधारित तरीकों जैसे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख8,12,13,14के द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । इन तरीकों के साथ महत्वपूर्ण विविधता सहित प्रमुख सीमाएं है इस्तेमाल किया कोशिकाओं के प्रकार, readout के प्रकार की सूचना दी, मानकीकरण की कमी और ट्राइग्लिसराइड्स 7,15के प्रभाव को ढूंढने । इन कमियों16बड़े नैदानिक अध्ययन के लिए कठिनाइयों मुद्रा । कोशिका मुक्त परख सेल आधारित परख की तुलना में एचडीएल समारोह के अधिक मजबूत उपाय दे सकता है । कोलेस्ट्रॉल समाप्ति एचडीएल के सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक है, लेकिन यह केवल सेल आधारित परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । प्रोटियोमिक्17,18,19,20,21,22,23जैसे एचडीएल फंक्शन का निर्धारण करने के लिए अंय दृष्टिकोण 24 और सेल आधारित monocyte chemotaxis की परख एचडीएल फंक्शन 17,22,25 का मानकीकृत नहीं किया गया है और इसका इस्तेमाल बड़े पैमाने पर मानव अध्ययन में नहीं किया जा सकता ।
एचडीएल महत्वपूर्ण एंटीऑक्सीडेंट atheroprotective प्रभाव5,6,7,8है । एचडीएल की एंटीऑक्सीडेंट फंक्शन पिछले सेल में एलडीएल की उपस्थिति में निर्धारित किया गया है नि: शुल्क fluorometric परख 26। एचडीएल एंटीऑक्सीडेंट समारोह के इन जैव रासायनिक fluorometric तरीके मूलतः मोहम्द Navab और एलन Fogelman और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किए गए थे26. हालांकि कई मानव अध्ययन एचडीएल समारोह का निर्धारण करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया है 17,18,19,20,21,22,23 ,24, लिपिड (एचडीएल)-लिपिड (एलडीएल) और लिपिड fluorochrome बातचीत कर सकते हैं सीमा reproducibility इन सेल मुक्त गैर एंजाइमी एचडीएल समारोह की जैव रासायनिक परख27,28.
हाल ही में ब्याज एचडीएल ऑक्सीकरण के कार्यात्मक परिणामों पर ध्यान केंद्रित किया है कि एचडीएल के भीतर लिपिड और प्रोटीन के ऑक्सीकरण का परिणाम है 27,29,30. पहले अध्ययनों से पता चला है कि एचडीएल के ऑक्सीकरण के साथ 27,29,30 एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड परिवहन में एक प्रमुख भूमिका है और लिपिड पेरोक्साइड की उच्च राशि असामान्य एचडीएल समारोह से संबंधित है । इस प्रकार एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री एचडीएल समारोह 9,17,20,31 और एचडीएल समारोह7के पूर्व परख के ज्ञात सीमाओं को देखते हुए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, 15,27,३२, हम एक वैकल्पिक fluorometric विधि विकसित की है कि quantifies एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री (HDLox) ३२। इस विधि एंजाइम सहिजन peroxidase (एचआरपी) और fluorochrome Amplex लाल है कि (कोलेस्ट्रॉल oxidase के बिना) एचडीएल-C ३२के प्रति मिलीग्राम लिपिड पेरोक्साइड सामग्री की मात्रा कर सकते हैं पर आधारित है । परख के जैव रासायनिक सिद्धांत चित्रा 1में दिखाया गया है । हमें पता चला है कि इस प्रतिदीप्ति आधारित दृष्टिकोण पहले एचडीएल समारोह परख27,28की सीमाएं नहीं है । यह परख और परिष्कृत किया गया है और हमारी प्रयोगशाला में मानकीकृत इतना है कि यह मज़बूती से बड़े पैमाने पर मानव अध्ययन cryopreserved प्लाज्मा ३२के साथ भी इस्तेमाल किया जा सकता है,३३,३४, ३५ , ३६ , ३७ , ३८ , ३९ , ४० , ४१ , ४२. इस परख के readout सत्यापित सेल के readouts के साथ जुड़ा हुआ है आधारित परख, हृदय रोग, प्रणालीगत सूजन, प्रतिरक्षा रोग और जुड़े हृदय और चयापचय जोखिम के किराए के उपाय phenotypes ३२ , ३३ , ३४ , ३५ , ३६ , ३७ , ३८ , ३९. यहां, हम एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री (HDLox) को मापने के लिए इस सरल, अभी तक मजबूत विधि का वर्णन करते हैं । इस परख एक उपकरण के लिए महत्वपूर्ण अनुसंधान मानव रोग में एचडीएल समारोह की भूमिका के बारे में सवाल का जवाब जहां प्रणालीगत सूजन, oxidative तनाव और ऑक्सीकरण लिपिड एक महत्वपूर्ण भूमिका (जैसे atherosclerosis)३२के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent</td>
			<td>Pointe Scientific</td>
			<td>H7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red reagent.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Esterase.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cholesterol Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Resorufin fluorescense Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Reaction Buffer.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL Cholesterol Automated Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>TR39601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 200, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>14-488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>&#160;14-387--955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 2.01 software</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Plate reader</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein

कम उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन कोलेस्ट्रॉल (एचडीएल-सी) के स्तर atherosclerotic हृदय रोग (सीवीडी) के सबसे शक्तिशाली स्वतंत्र नकारात्मक भविष्यवक्ताओं में से एक हैं । संरचना और एचडीएल के समारोह के बजाय एचडीएल-सी अधिक सही atherosclerosis भविष्यवाणी कर सकते हैं । कई एचडीएल प्रोटीन और लिपिड संरचना परिवर्तन है कि एचडीएल समारोह ख़राब ऐसे atherosclerosis के रूप में भड़काऊ राज्यों में होते हैं । एचडीएल समारोह आमतौर पर ऐसे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख के रूप में सेल आधारित परख द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन इन परख मानकीकरण के कई कमियां कमी है । कोशिका मुक्त परख सेल आधारित परख की तुलना में एचडीएल समारोह के अधिक मजबूत उपाय दे सकता है । एचडीएल ऑक्सीकरण एचडीएल फंक्शन को बाधित करते हैं । एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड परिवहन में एक प्रमुख भूमिका है और लिपिड पेरोक्साइड की उच्च राशि असामान्य एचडीएल समारोह से संबंधित है । लिपिड-जांच बातचीत जब गैर के परिणामों की व्याख्या पर विचार किया जाना चाहिए एंजाइमी प्रतिदीप्ति परख लिपिड oxidative राज्य को मापने के लिए । यह हमें प्रेरित एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री (HDLox) है कि एचडीएल रोग के लिए योगदान का आकलन करने के लिए एक सेल मुक्त जैव रासायनिक एंजाइमी विधि विकसित करने के लिए । इस विधि एंजाइम सहिजन peroxidase (एचआरपी) और fluorochrome Amplex लाल है कि (कोलेस्ट्रॉल oxidase के बिना) एचडीएल-C के प्रति मिलीग्राम लिपिड पेरोक्साइड सामग्री की मात्रा कर सकते हैं पर आधारित है । यहां एक प्रोटोकॉल एचडीएल लिपिड peroxidation का describedfor दृढ़ संकल्प है fluorochrome एजेंट का उपयोग कर । परख परिवर्तनशीलता प्रयोगात्मक शर्तों के सख्त मानकीकरण से कम किया जा सकता है । उच्च HDLox मूल्यों कम एचडीएल एंटीऑक्सीडेंट समारोह के साथ जुड़े रहे हैं । इस परख के readout सत्यापित सेल के readouts के साथ जुड़ा हुआ है आधारित परख, हृदय रोग के किराए के उपाय, प्रणालीगत सूजन, प्रतिरक्षा रोग, और जुड़े हृदय और चयापचय जोखिम phenotypes । यह तकनीकी दृष्टिकोण मानव रोग जहां प्रणालीगत सूजन, oxidative तनाव और ऑक्सीकरण लिपिड एक महत्वपूर्ण भूमिका (जैसे atherosclerosis) में एचडीएल समारोह का आकलन करने के लिए एक मजबूत तरीका है ।

प्रत्येक एचडीएल नमूने के ५० µ एल चरण ७.३ में प्रत्येक अच्छी तरह से में जोड़ रहे हैं । एचआरपी समाधान 5 यू/एमएल (०.२५ यू) के ५० µ एल फिर प्रत्येक अच्छी तरह से चरण ७.५ में के रूप में जोड़ रहे हैं । नमून...

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Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

हम यहां एक fluorometric कोशिका-एचडीएल लिपिड peroxidation के निर्धारण के लिए नि: शुल्क जैव रासायनिक परख का वर्णन । इस तेजी से और प्रतिलिपि परख बड़े पैमाने पर अध्ययन में एचडीएल समारोह का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और मानव रोग में एचडीएल समारोह की हमारी समझ में योगदान कर सकते हैं ।

उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन में लिपिड Peroxidation के उच्च प्रवाह माप के लिए सेल मुक्त जैव रासायनिक Fluorometric एंजाइमी परख

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